Berriak

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Minbizi-zelulek hainbat mekanismo garatu dituzte estres zelularra gainditzeko eta aurrera egiten jarraitzeko.Protein kinasa R (PKR) eta bere proteina aktibatzailea (PACT) zelulen ugalketa eta apoptosia inhibitzen duten estres-seinale desberdinak kontrolatzen dituzten hasierako erantzunak dira.Hala ere, minbizi-zeluletan PACT-PKR bidearen erregulazioa ezezaguna izaten jarraitzen du.Hemen, RNA luze ez-kodetzailea (lncRNA) aspartil tRNA sintetasa antisentino RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR bidearen inhibizioan zuzenean parte hartzen duela eta minbizi-zelulen ugalketa sustatzen du.CRISPRi 971 minbiziarekin lotutako lncRNA-ren eskala handiko baheketa funtzionala erabiliz, DARS-AS1 minbizi-zelulen ugalketa nabarmen hobetuarekin lotuta zegoela aurkitu genuen.Hori dela eta, DARS-AS1 knockout-ek zelulen ugalketa inhibitzen du eta minbizi-zelulen apoptosia sustatzen du in vitro hainbat minbizi-lerro zeluletan eta tumorearen hazkundea nabarmen murrizten du in vivo.Mekanikoki, DARS-AS1 PACT aktibazio-domeinura zuzenean lotzen da eta PACT-PKR elkarrekintza eragozten du, eta, ondorioz, PKR aktibazioa, eIF2α fosforilazioa eta zelula apoptotikoa heriotza inhibitzen du.Klinikoki, DARS-AS1 asko adierazten da minbizi anitzetan, eta lncRNA honen gehiegizko adierazpena pronostiko txarraren adierazgarri da.Ikerketa honek DARS-AS1 lncRNA-ren PACT-PKR bidearen minbiziari dagokion erregulazioa argitzen du eta minbiziaren pronostikorako eta tratamendurako beste helburu bat eskaintzen du.
Estresari egokitzeko gaitasuna minbizi-zelulen biziraupenaren eta ugaltzearen ezaugarri garrantzitsu bat da.Minbiziaren ugaltze azkarrak eta ezaugarri metabolikoak mikroingurune gogorretan (mantenugaien gabezia, hipoxia eta pH baxua) gailurra dute, zelulen heriotzaren seinaleztapen bideak eragin ditzaketenak.Estresarekiko sentikorrak diren geneen disregulazioa, esate baterako, p535, bero-shock proteinak 6, 7, KRAS8, 9 eta HIF-110, 11, 12, 13 maiz ikusten da minbizian, eta horrela apoptosia blokeatzen du eta biziraupena sustatzen du.
Protein kinase R (PKR) estres-sentsore garrantzitsu bat da eta 2α (eIF2α) eukariotoen hasierako faktorearen (eIF2α) estres zelularrarekin lotzen duen zelula-estresarekin lotzen duen subunitate-kinasa da.PKR jatorriz birusen aurkako proteina gisa identifikatu zen kate bikoitzeko RNA arrotz bat (dsRNA) detektatuz.Aktibazioan, PKR-k eIF2α fosforilatzen du proteina birikoaren eta zelularen sintesia inhibitzeko14,15,16.PACT (PKR activator protein) dsRNA17,18,19,20,21,22,23 ezean lehen PKR proteina aktibatzaile gisa identifikatu da.PKRrekin zuzeneko elkarreraginaren bidez, PACTek hainbat estres (serum gosea, peroxidoa edo arsenitoaren tratamendua) PKRra eta beherako seinaleztapen bideetara eramaten ditu.EIF2α fosforilazioaz gain, PACT bidezko PKR aktibazioa estresaren erantzunarekin lotutako hainbat gertakari abiarazten ditu, besteak beste, PI3K/Akt24 bidearen bidez erredox egoera aldatua, DNAren kalteen egiaztapena hobetua p5325,26 eta NF-κB27,28 transkripzioa erregulatzen du, 29. Estresaren erantzunean, ugaltzean, apoptosian eta beste zelula-prozesu gako batzuetan duten zeregin kritikoa kontuan hartuta, PKR eta PACT gaixotasun askoren helburu terapeutiko itxaropentsuak dira, batez ere minbizia30,31,32,33.Hala ere, esanahi funtzional eta biologiko pleiotropiko hori izan arren, minbizi-zeluletan PACT/PKR jardueraren erregulazioa iheskorra izaten jarraitzen du.
LncRNAak 200 nukleotido baino handiagoak diren transkripzioak dira, proteinak kodetzeko potentzialik ez dutenak.Punta-puntako genoma osoa sekuentziatzeko proiektuek milaka lncRNA identifikatu dituztenetik,35,36 ahalegin handia egin da haien funtzio biologikoak argitzeko.Gero eta gehiago ikerketa-talde batek frogatu du lncRNA-ek prozesu biologiko askotan parte hartzen dutela37, besteak beste, X kromosomaren inaktibazioa38,39, inprimaketa40, transkripzioa41,42, itzulpen43 eta baita minbiziaren hazkuntza44,45,46,47 ere.Ikerketa hauek lncRNA asko PACT/PKR bidean parte hartzen dutela jakinarazi dute.Halako ikerketa batek erakutsi zuen lncRNA ASPACTek PACT transkripzioa inhibitzen zuela eta PACT mRNAren atxikipen nuklearra areagotu zuela.Beste ikerketek frogatu dute lncRNA nc886 PKRrekin lotzen dela eta haren fosforilazioa inhibitzen duela49,50.Orain arte, PACT bidezko PKR aktibazioa erregulatzen duen lncRNA ez da jakinarazi.
Aspartyl-tRNA sintetasa antisentent RNA 1 (DARS-AS1) lncRNA onkogeno gisa identifikatu da51,52,53,54.MiP-194-5p53, miP-12952 eta miP-532-3p51 erregulazioaren bidez, DARS-AS1-ek zelula argien giltzurrun-zelulen kartzinoma, tiroideo kartzinoma eta zelula ez-txikietako biriketako kartzinomaren hazkundea sustatzen duela frogatu da.Tong-ek eta lankideek ere aurkitu zuten DARS-AS1-ek mielomaren progresioa sustatzen duela, 39 proteinaren (RBM39) RNA-lotzeko motiboaren egonkortasuna mantenduz.Hala ere, ez da ikerketarik egin lncRNA honek PACT-PKR aktibazioan eta minbizi-zelulen estresaren erantzunean parte hartzen duen ala ez jakiteko.
Hemen, eskala handiko funtzio-galera pantaila bat egin genuen CRISPRi sistema erabiliz eta DARS-AS1 lncRNA-k hainbat minbizi-zelulen ugaltzea sustatzen duela zehaztu genuen.Horrez gain, mekanismo nagusi bat identifikatu dugu: DARS-AS1 PACT-ekin zuzenean lotzen da, PACT eta PKR lotura inhibitzen du, eIF2α-ren, PKR substratu baxuago baten fosforilazioa eragozten du eta, azken batean, zelulen heriotza apoptotikoa galarazten du.Amaitzeko, gure lanak DARS-AS1 lncRNA PACT-PKR bidearen erregulatzaile gisa eta minbiziaren tratamendurako eta pronostikorako helburu potentzial gisa erakusten du.
Profil genomikoaren azterketa zabalek minbiziarekin lotutako ehunka lncRNA identifikatu dituzte.Hala ere, haien funtzioa ezezaguna izaten jarraitzen du56.Minbiziaren progresioan parte hartzen duten lncRNA hautagai itxaropentsuak identifikatzeko, SW620 kolorektaleko minbiziaren zelula-lerroan ugalketa murrizteko funtzio-galera pantaila bat egin genuen CRISPRi sistema erabiliz (1a. irudia).SW480 eta SW620 koloneko minbiziaren zelula-lerroen ezaugarri berezia paziente bakarreko tumore primarioetatik eta sekundarioetatik eratorritakoa da.Honek konparazio baliotsua eskaintzen du koloneko minbizi aurreratuaren progresioan aldaketa genetikoak aztertzeko.Hori dela eta, koloneko minbiziaren zelula-lerroen (SW480 eta SW620) transkriptomak aztertu ditugu RNA sekuentziazioa erabiliz eta lncRNA funtzional potentzial batzuk bildu ditugu argitaratutako literaturatik.Emaitza hauetan oinarrituta, 7355 sgRNA oligos dituen sgRNA liburutegi bateratua diseinatu dugu 971 minbiziarekin lotutako lncRNA eta helburu gabeko 500 sgRNA oligos kontrol negatibo baterako (datu osagarriak 1).
Emanaldiaren irudikapen eskematikoa CRISPRi sistema erabiliz.b sgRNA aberastea screening ondoren.Puntudun lerro horizontalak log2 (tolesdura-aldaketa) = ±0,58 adierazten du.Puntu bertikalak p balioa = 0,05 adierazten du.Puntu beltzak helburu ez den sgRNA adierazten dute (NC gisa izendatua).Puntu gorriak DARS-AS1 helburu duten sgRNAak dira.Puntu urdinak LINC00205 helburu duten sgRNA dira, aurretik deskribatutako lncRNA onkogeno bat.tolesdura aldaketa = (irakurketa normalizatua, 17. eguna)/(irakurketa normalizatua, 0. eguna).c DARS-AS1 sgRNA knockdown zelulen hazkundea inhibitu zuen.Errore-barrak hiru esperimentuen ± desbideratze estandarra adierazten dute.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 bi isatseko Student-en t-testa.d DARS-AS1 adierazpena tumoreetan (TCGA datu multzoa).em DARS-AS1-aren adierazpena BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP eta COAD duten pazienteen pareko lagin normaletan eta tumoreetan, hurrenez hurren (TCGA datu-multzoa).p-balioak parekatuta bi isatseko Student-en t-testa erabiliz lortu ziren.
Plasmidoa eraiki eta lentibirusa ontziratu ondoren, dCas9-SW620 kolorektaleko minbiziaren zelula-lerroa goiko liburutegiarekin transduzitu genuen lau infekzio-esperimentu independenteetan.Infekzio hauen infekzio-aniztasuna (MOI) 0,1-0,3 izan zen, zelula bakoitza sgRNA batekin soilik transfektatu daitekeela adierazten du.18 egun in vitro kulturaren ondoren, helburuko sgRNA-en aberaste-profila txikitu edo handitu egin zen baheketaren ondoren, norakoak ez diren kontrol-oligonukleotidoen kopurua nahiko aldatu gabe geratu zen, aurre-baheketa-profilarekin alderatuta, gure helburuak pantaila-espezifikoa duela adierazten du. liburutegia.Arroza.1b eta taula osagarria 1). LINC00205, aurretik biriketako minbizia eta gibeleko minbiziaren progresioa sustatzen zuela jakinarazi zuten58,59,60, kanporatu zen (log2 (foldchange) <-0.58, p balioa <0.05), baheketa honen fidagarritasuna baieztatuz (1b. irudia). LINC00205, aurretik biriketako minbizia eta gibeleko minbiziaren progresioa sustatzen zuela jakinarazi zuten58,59,60, kanporatu zen (log2 (foldchange) <-0.58, p balioa <0.05), baheketa honen fidagarritasuna baieztatuz (1b. irudia). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, aurretik biriketako minbiziaren eta gibeleko minbiziaren progresioa sustatzen zuela jakinarazi zuen58,59,60, baztertu egin zen (log2 (fold aldaketa) <-0.58, p-balioa <0.05), baheketa honen sendotasuna baieztatuz (.1b. irudia) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 促进 促进 和 肝癌 进展 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-00.58, P 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 促进 促进 和 肝癌 进展 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-00.58, P 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的 可靠性 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, aurretik biriketako eta gibeleko minbiziaren progresioa sustatzen zuela jakinarazi zuen58,59,60, baztertu egin zen (log2 (fold aldaketa) <-0.58, p-balioa <0.05), baheketa honen sendotasuna baieztatuz (.1b. irudia).
Probatu diren lncRNA guztien artean, DARS-AS1 ere probatu zen, 18 eguneko sgRNA oligonukleotidoak nabarmen murriztuta, lncRNA honen kolpeak minbiziaren ugalketa murriztu zuela iradokiz (1b. irudia).Emaitza hau koloneko minbizi-zeluletan MTS analisiak lagundu zuen, DARS-AS1 knockdown zelulen hazkuntza-tasa erdira bakarrik murriztu zela kontrol-zelulekin alderatuta (1c irudia) eta beste hainbat minbizi motaren aurreko txostenekin bat zetorrela.: zelula argiko giltzurruneko minbizia, tiroideoko minbizia eta zelula ez-txikietako biriketako minbizia51,52,53,55.Hala ere, kolore-onteko minbizian duen funtzioa eta mekanismo molekularrak aztertu gabe jarraitzen dute.Hori dela eta, lncRNA hau aukeratu dugu gehiago aztertzeko.
Pazienteetan DARS-AS1 adierazpena aztertzeko, Cancer Genome Atlas (TCGA) proiektuko 10.327 tumore lagin aztertu ditugu.Gure emaitzek erakusten dute DARS-AS1 oso zabalduta dagoela eta nabarmen gora egiten duela zelula osasuntsuetan hainbat tumoretan, besteak beste, koloneko adenokartzinoma (COAD), giltzurruneko zelula garbien kartzinoma (KIRC) eta giltzurruneko zelula papilarreko kartzinoma (KIRP)..Oso gutxi (1d irudia eta 1a, b irudi osagarria). Bikote osasuntsu/tumoreen laginen analisiak gehiago baieztatu du DARS-AS1-en adierazpen nabarmen handiagoa dela maskuriko uroteliako kartzinoma (BLCA), giltzurruneko giltzurruneko zelula garbien kartzinoma (KIRC), prostatako adenokartzinoma (PRAD), biriketako zelula ezkatadun kartzinoma (LUSC) tumoreetan. , umetokiko gorputzeko endometrioko kartzinoma (UCEC), biriketako adenokartzinoma (LUAD), gibeleko hepatozelularreko kartzinoma (LIHC), giltzurruneko giltzurruneko zelula papilarreko kartzinoma (KIRP) eta koloneko adenokartzinoma (COAD) (p balioa < 0,05) (1e-m irudia) . Bikote osasuntsu/tumoreen laginen analisiak gehiago baieztatu du DARS-AS1-en adierazpen nabarmen handiagoa dela maskuriko uroteliako kartzinoma (BLCA), giltzurruneko giltzurruneko zelula garbien kartzinoma (KIRC), prostatako adenokartzinoma (PRAD), biriketako zelula ezkatadun kartzinoma (LUSC) tumoreetan. , umetokiko gorputzeko endometrioko kartzinoma (UCEC), biriketako adenokartzinoma (LUAD), gibeleko hepatozelularreko kartzinoma (LIHC), giltzurruneko giltzurruneko zelula papilarreko kartzinoma (KIRP) eta koloneko adenokartzinoma (COAD) (p balioa < 0,05) (1e-m irudia) .Bikote osasuntsu/tumore-laginen analisiak DARS-AS1-en adierazpide nabarmen handiagoa ere baieztatu du maskuriko uroteliako kartzinoma (BLCA), zelula argiko giltzurruneko eta giltzurruneko zeluletako kartzinoma (KIRC), prostatako adenokartzinoma (PRAD), biriketako zelula ezkatsuko kartzinoma (LUSC) tumoreetan., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , umetokiko endometrioko kartzinoma (UCEC), biriketako adenokartzinoma (LUAD), gibeleko kartzinoma hepatozelularra (LIHC), giltzurruneko zelula papilarreko kartzinoma (KIRP) eta koloneko adenokartzinoma (COAD) (p balioa < 0,05) (1e– m. irudia) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 Dars-As1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA), 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC), 前列 腺腺癌 (Prad), 肺鳞状肺鳞状 (Lusc) 肿瘤 中中显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (Lihc), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (Kirp) 和结肠腺癌 (coad) (coad) (p 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 的 分析 证实 了 Dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌, 肾 肾 腺腺癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad), 细胞癌细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 显着 中 中 中 中 显着 更 高 表达, 内膜 癌 ((Ucel) 肺腺癌 (Luad) 肝肝 细胞癌 (Lihc) 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Osasuntsu/tumoreen pareko laginen analisiak DARS-AS1-ek maskuriko uroteliako kartzinoma (BLCA), zelula argiko giltzurruneko zelulen kartzinoma (KIRC), prostatako adenokartzinoma (PRAD) eta biriketako zelula ezkatadun kartzinoma (LUSC) tumoreetan lagundu zuen.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). gorputz-umetokiko kartzinoma (UCEC), biriketako adenokartzinoma (LUAD), kartzinoma hepatozelularra (LIHC), giltzurruneko zelula papilar kartzinoma (KIRP) eta koloneko adenokartzinoma (COAD) (p balioa <0,05) (1e -m irudia).Emaitza hauek batera hartuta, DARS-AS1 askotariko minbizietan oso adierazgarria eta zabala dela adierazten dute.
DARS-AS1 eta DARS (zentzuaren aurkako katea kodetzen duen genea) sustatzaile bera partekatzen dutenez eta bata bestearen ondoan kokatzen direnez, shRNA diseinatu dugu DARS-AS1 berariaz kentzeko, baina ez DARS (2a, b irudi osagarria eta 2 taula osagarria) .SW620-z gain, DARS-AS1 oso adierazgarria duten beste hiru zelula-lerro ere erabili ditugu shRNA knockdown-aren eraginkortasuna eta funtzioa aztertzeko (3. taula osagarria).Gure emaitzek adierazi zuten garatutako hiru shRNAek DARS-AS1 knockdown eraginkortasuna gutxienez % 80 lortu zutela DARS mRNA-ren kantitatean eragin gutxirekin (2c-f irudi osagarria).Horrez gain, shRNA hauekin DARS-AS1 knockdown-ek SW620 (% 49,7) eta HCT116 (% 27,7) koloreko minbiziaren zelula-lerroen zelulen hazkundea nabarmen inhibitu zuen, MBA-MD-231 (% 53,4) bularreko minbiziaren zelula-lerroetan.) eta HepG2 hepatoma zelula-lerroa (% 92,7ko murrizketa), baita ainguratu gabeko esferak osatzeko duten gaitasuna ere (% 50,8, % 44,6, % 40,7 eta % 75,7ko zelula-lerro bakoitzeko batez besteko murrizketa) (2a,b irudiak).SW620-n, koloniak eratzeko saiakeraren emaitzek gehiago baieztatu zuten DARS-AS1 shRNA-k nabarmen inhibitu zuela zelulen ugalketa batez beste % 69,6 gutxi gorabehera (2c. irudia).
Kontrol shRNA eta DARS-AS1 shRNAren eragina zelulen ugalketan (a) eta esferoideen eraketan (b) SW620, HCT116, MBA-MD-231 eta HepG2 zeluletan.c Kontroleko shRNA eta DARS-AS1 shRNAren eragina SW620 zeluletan kolonia eratzean.DARS-AS1 gainespresatzen duten SW620 zelulen ugalketa zelularra (d), esferoideen sorrera (e) eta kolonia eraketa (f).Erakutsitako datuak hiru esperimenturen batez besteko ± desbideratze estandarra dira.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 eta *** p ≤ 0,001 bi isatseko Student-en t-testaren bidez.
Funtzio-galera-azterketak osatzeko, hurrengo DARS-AS1 gainespresatzen duten SW620 zelulak sortu ditugu (2g irudi osagarria).DARS-AS1 gainadierazpenak nabarmen handitu zituen zelulen hazkundea (1,8 aldiz), ainguratu gabeko esferoideen eraketa (1,4 aldiz) eta kolonia eraketa (3,3 aldiz) SW620 zeluletan (2d-f irudiak).Emaitza hau beste DARS-AS1 adierazten duen zelula-lerro bat erabiliz baieztatu dugu, A549.DARS-AS1 gainadierazpenaren ondorioz zelula-ugalketa hobetu hau A549 zeluletan ikusi zen (2h irudi osagarria, i eta 3. taula osagarria).Batera hartuta, irabazi- eta galera-ikerketa hauek frogatzen dute DARS-AS1-ek minbizi-zelulen ugalketa in vitro sustatzen duela.
DARS-AS1-ek zelulen ugalketa erregulatzen duen azpian dagoen mekanismoa aztertzeko, RNA pull-down analisi bat egin dugu proteinak lotzen dituen bazkide potentzialak identifikatzeko.RT-qPCR emaitzek erakutsi zuten DARS-AS1-en % 86,2 inguru SW620 zelulen zitoplasman kokatzen dela (3a irudi osagarria).In vitro transkribatutako DARS-AS1 edo pseudoRNA biotinilatua SW620 zelula lisatuekin inkubatu zen eta ondoren SDS-PAGE bereizketa egin zen.Ondorengo zilarrezko tindaketak erakutsi zuen banda desberdin bat (~ 38 kDa) nabarmen aberastu zela DARS-AS1 tira-laginetan, baina ez RNA edo aleen laginetan (3a. irudia).Banda hau PKR aktibatzeko proteina (PACT) gisa identifikatu zen masa-espektrometriaren bidez (MS) eta immunoblotting bidez baieztatu zen SW620, HCT116 eta HepG2 zelula-lerroetan (3a, b irudiak).DARS eta erlazionatutako PACT proteinen aberastea - PKR eta TRBP - Western blotting bidez (WB) RNA analisia erabiliz ere ikertu zen.Emaitzek adierazi zuten ez zela DARS-AS1 RNAren eta hiru proteina horien arteko interakzio zuzenik aurkitu (3b irudi osagarria).DARS-AS1 eta PACTen arteko elkarrekintza espezifikoa RNA immunoprecipitation (RIP) analisiaren bidez berretsi zen, eta horrek erakutsi zuen DARS-AS1 PACTaren aurkako antigorputzetan nabarmen aberastu zela baina ez beste kontrol RNA batzuetan (3c irudia).DARS-AS1-ek PACT-ekin zuzenean elkarreragiten duen zehazteko beste osagai zelularrik ezean, in vitro biogeruzako interferometria (BLI) saiakuntza bat egin zen PACT araztua erabiliz.Biotinaz markatutako DARS-AS1 edo RNA finkoa streptavidin (SA) biosentsoreetan inmobilizatu zen eta gero 1 μM PACT zuen buffer zinetiko batean inkubatu zen.Nabarmentzekoa, PACT oso lotu zen DARS-AS1-ekin (KD balioa ~ 26,9 nM), baina ez RNA imitatzera (3d irudia).Batera hartuta, emaitza hauek DARS-AS1 eta PACT-en arteko elkarrekintza zuzena eta afinitate handia erakusten dute.
RNA pull analisiak DARS-AS1 PACT-ekin elkarreraginean identifikatu zuen SW620 zeluletan.Goian, erlazionatutako proteinen zilarrezko tindaketa.Beheko immunoblots PACTaren aurkako antigorputzekin egin ziren.b RNA pull-down analisia HCT116 (goian) eta HepG2 (behean) zeluletan egin zen.PACT aberastea immunoblotting bidez detektatu zen.cRNA immunoprecipitation (RIP) entseguak SW620 zeluletan egin ziren adierazitako antigorputzak erabiliz.d PACT lotzeko kurbak luzera osoko DARS-AS1 edo kontrol RNArekin biogeruzako interferometria (BLI) erabiliz lortu dira.RNA streptavidin biosentsore batean inmobilizatu zen.1 μM PACT erabili da elkartea neurtzeko.RNA tiraren saiakuntza luzera osoko DARS-AS1 biotinilatua edo moztua (goian) erabiliz egin zen.Jasotako PACT erakusten duen immunoblot (behean).f Purifikatutako PACT luzera osoko DARS-AS1 biotinilatuarekin inkubatu zen edo moztuta (e-n bezala) in vitro RIP saiakuntzarako.Erauzitako RNA RT-qPCR bidez egiaztatu zen.g RNA zati ezberdinen PACTarekiko duten afinitate erlatiboa biogeruzako interferometria erabiliz lortu da.Analisirako, 100 nM RNA eta 1 μM RAST erabili ziren.h In vitro RIP entseguak PACT etiketadun oso-osorik edo moztuta erabiliz egin ziren.Erauzitako RNA RT-qPCR bidez egiaztatu zen.i DARS-AS1, PACT edo biak gainespresatzen duten SW620 zelulen hazkuntza-tasa.j SW620 zeluletan DARS-AS1 luze edo moztuaren gainespresioak eragin desberdinak izan zituen zelulen hazkundean.k Apoptosia PARParen aurkako antigorputz immunoblotting bidez detektatu zen.l DARS-AS1-en kanporaketak SW620 zelulen apoptosia eragiten du fluxu-zitometriak erakusten duen moduan.Erakutsitako datuak hiru esperimenturen batez besteko ± desbideratze estandarra dira. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, bi isatseko Student-en t testaren bidez. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, bi isatseko Student-en t testaren bidez. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 Student bi buztanen t-testaren bidez. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 Student bi buztanen t-testaren bidez.
Ondoren, DARS-AS1 RNA biotinilatutako hiru zati sortu genituen in vitro transkripzioaren bidez, PACT elkarterako beharrezkoa den DARS-AS1 eskualdea identifikatzeko (3e irudia).RNA analisiaren emaitzek erakutsi zuten zati bakoitza PACT-ekin elkarreragiteko gai zela, baina 3′-terminalaren eskualdeak (384-768 nukleotido A3 etiketatuta) A1 markatutako 1-384 nukleotido baino gehiago erakutsi zituen (3e. irudia).Antzeko emaitzak ikusi ziren in vitro RIP saiakuntzan PACT birkonbinatzailea erabiliz (3f irudia).Emaitza hauekin bat etorriz, inmobilizatutako RNA zatiak PACTera BLI erabiliz lotzeko esperimentuek ere erakutsi zuten PACTek A3rekiko afinitate handiagoa duela (384-768 nt) (KD balioa 94,6 nM gutxi gorabehera), beste eremu batzuekin ia loturarik ez duen bitartean.(3d. irudia).
PACT-en lotutako lotura-eskualdeak ere aztertu ditugu.PACTek hiru domeinu funtzional ditu, horietako bi RNA-lotura bikoitzeko domeinu kontserbatuak (dsRBD) eta hirugarren domeinu bat (D3 izendatua) proteina-interakzioen aktibatzaile gisa jokatzen duena.Domeinu bakoitzaren lncRNA lotzeko ahalmena aztertzeko, hiru domeinuetako bakoitza kendu eta in vitro RIP entsegu bat egin genuen hiru mutazio diseinatu genituen.Gure emaitzek PACT-en hirugarren domeinua (D3) ezabatzeak DARS-AS1-ekin duen interakzioa nabarmen murriztu zuela (0,11 aldiz PACT oso-osoarekin alderatuta) beste bi mutazioekin alderatuta (3h. irudia), frogatu zen askapena zela. D3-k DARSekin elkarreragin zuen.-AC1.Emaitza hauek batera hartuta, DARS-AS1 eta PACT-en arteko elkarrekintza batez ere DARS-AS1-en 3′ amaieran eta PACT-en D3 domeinuaren bidez gerta daitekeela iradokitzen dute.
DARS-AS1-ek ez zuela eraginik PACT adierazpenean eta PACTek ez zuela eraginik DARS-AS1-en (3c irudi osagarria).Ondoren, PACT knockdown-ek zelulen hazkundean duen eragina aztertu dugu.DARS-AS1-en aldean, zelula erlatiboak 1,5-3 aldiz azkarrago hazi ziren PACT bota zutenean (3d irudi osagarria).Koloniak eratzeko saiakeraren emaitzek adierazi zuten zelulek 2-3 aldiz koloniak eratu zirela PACT-ekin shRNA tratamenduaren ondoren (3e irudi osagarria).DARS-AS1 PACT bidez zelulen ugalketa erregulatzen duen ala ez probatzeko, PACT, DARS-AS1 edo biak gainespresatzen duten SW620 zelulak sortu ditugu.PACT-en gehiegizko adierazpenak zelulen ugalketaren inhibizio esanguratsua erakutsi zuen (3i irudia).DARS-AS1 gainadierazpenak berez zelulen ugalketa nabarmen sustatu zuen arren, ez zen ezberdintasun handirik egon DARS-AS1 eta PACT gainespresatzen zuten zelulen hazkuntza-tasan.Emaitza hauek iradokitzen dute PACTek DARS-AS1 gainespresioak eragindako ugalketa areagotuari aurre egin diezaiokeela.
DARS-AS1-en eskualde ezberdinek PACT lotzeko gaitasun desberdinak dituztenez, zelulen ugalketan duten eragin erlatiboa ikertu dugu DARS-AS1 zatien gainespresio desberdinen bidez.Beste bi zatiekin alderatuta, DARS-AS1 3' muturrean (384-768 nt) gainespresatu zen, DARS-AS1-en PACT-ekin erlazionatutako eskualde nagusia, zelularen ugalketa suspertzeko gaitasun handiena zuena (3j. irudia).Emaitza hauek DARS-AS1-en lotura-ahalmenaren eta funtzio biologikoaren arteko korrelazio positiboa adierazten dute.
PACT proteina pro-apoptotikoa dela jakinarazi da19.Hori dela eta, DARS-AS1-ek apoptosian duen eragina ikertu dugu.Espero zen bezala, DARS-AS1 knockdown-ek PARP mozketa nabarmen handitu zuen SW620 zeluletan eta anexin V-positiboen zelulen proportzioa handitu zuen SW620, HCT116, HepG2 eta MBA-MD-231 zelula-lerroetan (3k. irudia).3).3f–h), DARS-AS1-en efektu anti-apoptotikoa minbizi-zeluletan PACT-en apoptosia eragiten duen funtzioaren aurkakoa dela adierazten du.Emaitza hauek batera hartuta, DARS-AS1 funtzio onkogenikoaren mekanismoa PACT funtzioaren inhibizioaren bidez izan daitekeela iradokitzen dute.
Ondoren, DARS-AS1-PACT elkartearen inplikazio funtzionalak aztertu ditugu.PACT-ek interakzio zuzenaren bidez PKR aktibatzen duela jakinarazi da, eta, ondoren, eIF2α fosforilazioa hobetzen du, translazio-ezabapena eta apoptosia eraginez17.Lehenik eta behin, DARS-AS1-ek PACT eta PKRren lokalizazio zelularra eragiten duen aztertu dugu.Fluoreszentzia-mikroskopia konfokalak PACT eta PKR oso kolokanizatuta zeudela SW620 zeluletan Pearsonen batez besteko korrelazio koefizientearekin 0,72koa izan zen.Bien bitartean, DARS-AS1 gainespresioak PACT eta PKR ko-lokalizazioa nabarmen murriztu zuen (Pearsonen batez besteko korrelazio koefizientea 0,61) (4a irudia).DARS-AS1-ek PACT-PKR elkarrekintza modulatu zezakeen ala ez ikertzeko, ko-immunoprecipitation (co-IP) saiakuntza bat egin genuen SW620 zelulen lisatuetan anti-PACT antigorputzarekin.PKR oso aberastu zen kontrol-zeluletan PACTen aurkakoa, eta PKR berreskurapena nabarmen murriztu zen DARS-AS1 gainespresatzen zuten zelulen lisatuetan (4b. irudia).PACT eta PKR etiketadun araztuak in vitro proteina lotzeko entseguetarako erabili ziren.Horren arabera, DARS-AS1 baina kontrol RNArik ez zutenek PACT-PKR interakzioa kendu zuten (4c irudia).Emaitza guztiek erakutsi zuten DARS-AS1-ek PACT eta PKR komunikazioa eten zuela.
a PACT eta PKR kontroleko zeluletan edo DARS-AS1 gainespresatzen zuten zeluletan ko-lokalizazioa ikusi zen fluoreszentzia-mikroskopia konfokala erabiliz.Nukleoak DAPIz tindatu ziren.Emaitza estatistikoak 16 argazkitan lortu dira.b Co-immunoprezipitazioa (co-IP) kontroleko SW620 zelulen edo DARS-AS1 gainespresatzen duten zelulen lisatu zeluletan PACT antigorputza erabiliz.c PACT etiketatua, PKR araztua eta DARS-AS1 edo RNA simulatuarekin in vitro transkribatuta inkubatu ziren in vitro proteinen lotura analisirako.Banderaren aurkako antigorputzak erabili ziren immunoprezipitaziorako.d Adierazitako antigorputzekin immunoblots egin ziren kontrol shRNA edo DARS-AS1-shRNArekin transfektatutako SW620 eta HCT116 zeluletan eta ondoren serum gosea izan zen.e DARS-AS1 adierazpen mailak thapsigarginarekiko sentikortasun zelularra aldatu zuen.SW620 zelulak DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 gainespresio plasmidoarekin edo kontrol plasmidoarekin transfektatu ziren.Zelulak thapsigarginarekin tratatu ziren 48 orduz eta zelulen bideragarritasuna MTS erreaktiboa erabiliz zehaztu zen.f In vitro transkribatutako DARS-AS1 edo RNA finkoa eta araztutako PACT erabili ziren in vitro aktibazio-saiakuntzarako eta immunoblot detektatzeko.g Antigorputz hauek erabiliz immunoblots egin ziren SW620-ctrl zeluletan (ezkerrean) edo PKR mutanteak gainespresatzen zituzten zeluletan (eskuinean).Ondoren, zelula hauek kontrol shRNA edo DARS-AS1-shRNArekin transfektatu ziren eta ondoren serum gosea izan zen.h Fluxu-zitometriak erakutsi zuen PKR mutantearen inaktibitateak SW620 zeluletan DARS-AS1-ek eragindako apoptosia konpentsatzen zuela.i Adierazitako antigorputzak dituzten immunoblotsak SW620 (ezkerrean) edo HCT116 (eskuinean) zeluletan egin ziren.Kontrol shRNA edo DARS-AS1 shRNArekin transfektatutako zelulak serum gabetuak dira eta 100 nM PKR C16 inhibitzailearekin edo DMSOrekin osatzen dira.Eskala barra = 5 µm.Erakutsitako datuak hiru esperimenturen batez besteko ± desbideratze estandarra dira.* p ≤ 0,05 bi isatseko Student-en t-testa.
Orokorrean uste da PACT-ek PKR17-rekin elkarreragiten duenean, Thr451-en PKR fosforilazioa eragin daitekeela.Gure emaitzek adierazi zuten PKR fosforilazio maila nabarmen igo zela DARS-AS1 knockdown zeluletan serum gosearen ondoren (4d irudia eta 4a irudi osagarria).Horren arabera, eIF2α-ren fosforilazioa, PKR substratu nagusia, DARS-AS1 shRNA-k ere nabarmen handitu zuela aurkitu genuen (4d irudia eta 4a irudi osagarria).Thapsigargina ER estressor bat da, eta ERk Ca2+ askatzen du.Thapsigarginarekin tratamenduak PACT-en adierazpena eta aktibazioa eragiten duela jakinarazi da, eta horrek PKRrekin gehiago elkarreragin eta aktibatzen du, apoptosia eraginez eIF2α fosforilazioa areagotuz 18,61.Hemen, thapsigargina PACT/PKR bidearen estimulatzaile gisa erabili dugu DARS-AS1-ek zelulek estresa gainditzen lagun dezaketen PACT/PKR bidea inhibituz ikertzeko.DARS-AS1 adierazpen maila thapsigarginarekiko zelulen erresistentziarekin positiboki erlazionatuta zegoela ikusi genuen.DARS-AS1 gainespresatzen zuten SW620 zelulek hobeto bizirik irauten zuten thapsigarginarekin tratatuta, eta DARS-AS1 knockdown zuten zelulak jasangarriagoak ziren bitartean (4e. irudia).Emaitza hauekin bat, DARS-AS1 gainespresioak thapsigarginak eragindako PKR fosforilazioa murriztu zuen (4b irudi osagarria).Aitzitik, thapsigargin tratamenduaren ondoren, PKR eta eIF2α neurri handiagoan fosforilatu ziren DARS-AS1 knockdown zeluletan kontrol-zelulekin alderatuta (4b irudi osagarria).Interesgarria da thapsigarginak DARS-AS1 adierazpena dosiaren araberako eran eragin zuen, eta horrek DARS-AS1-en estresaren aurkako funtzioa adieraz dezake (4c irudi osagarria).Horrez gain, in vitro aktibazio-saiaketak egin ditugu behaketa hauek baieztatzeko.Laburbilduz, PKR zelulen lisatuetatik araztu zen PKRren aurkako antigorputz bat erabiliz, gero PACT errekonbinatzailearekin eta DARS-AS1 in vitro transskribatuta inkubatu zen.Erreakzio entzimatikoaren ondoren, fosfo-PKR detektatu zen WB erabiliz.Gure emaitzek adierazi zuten PKR fosforilazioa DARS-AS1-ek nabarmen inhibitu zuela, baina ez kontrol RNA-k (4f irudia).In vitro eta in vivo emaitza hauek DARS-AS1 PACT bidezko PKR aktibazioa inhibitzen duela iradokitzen dute.Aldi berean, DARS-AS1-en presentzian PACT berreskurapenaren jaitsiera ere ikusi dugu (4f irudia).Emaitza hau bat dator in vitro proteina lotzeko saiakuntzaren emaitzekin (4c irudia) eta berriro DARS-AS1-en blokeo-funtzioa PACT-PKR elkarterako erakusten du.
Ser246 eta Ser287 PACT-en D3 domeinuan beharrezkoak dira PKR aktibatzeko estres zelularrean.Alaninaren bi serina-hondarren ordezkapenak PACT mutantea (mutD) eman zuen, estresik ezean PKR aktibatu zuena, eta alaninaren ordezkapenak (mutA) protokoloa alderantzikatu zuen.DARS-AS1-ekin zuzeneko loturan domeinu honek duen garrantzia frogatu dugunez, bi PACT mutante hauek sortu ditugu hondakin horiek DARS-AS1-ekin elkarrekintzan ere parte har dezaketen probatzeko.Interesgarria da bi mutanteek DARS-AS1-ekin lotzeko gaitasuna galdu zuten (4d irudi osagarria), iradokiz PACT proteinaren egitura osoa beharrezkoa izan daitekeela DARS-AS1-ekin elkarrekintza eraginkorra izateko.
Gainera, gure emaitzek ere iradokitzen dute DARS-AS1-shRNA-k zelulen ugalketaren inhibizioa partzialki berreskuratu daitekeela PACT mutante negatibo nagusi bat (PACTmutA) edo PKR mutante negatibo nagusi bat (PKRmut) gainespresatuz (4e. e. irudi osagarria).PKR mutante dominante-negatiboen gainespresioak DARS-AS1 knockdown-ek eragindako PKR fosforilazioa eta eIF2α fosforilazioa murriztu zuen serum gabeko zeluletan (4g. irudia).Are garrantzitsuagoa dena, DARS-AS1 kolpeak eragindako zelula apoptotikoen proportzioa ere murriztu zen PKRmut gainespresatzen zuten zeluletan (4h. irudia eta 4g. irudi osagarria).PKR kinasaren jardueraren inhibizioak DARS-AS1 funtzioa ere kaltetzen du, izan ere, emaitzek erakutsi zuten DARS-AS1 knockdown-ak oso gutxitan eragiten zuela PKR eta eIF2α fosforilazioa zelulak PKR-eko C16 inhibitzaile espezifiko batekin tratatzen zirenean (4i irudia eta 4h irudi osagarria).).Batera hartuta, gure emaitzek iradokitzen dute DARS-AS1-ek zelulen ugalketa sustatzen duela, neurri batean behintzat, PACT bidezko PKR aktibazioa inhibituz.
DARS-AS1-ek tumorigenesian duen eginkizuna gehiago aztertzeko, in vivo esperimentuak egin ditugu saguaren xenoinjerto-eredu bat erabiliz. Emaitzek erakusten dute DARS-AS1-en kolpeak saguetan tumore-hazkundea izugarri murriztu zuela (p balioa < 0,0001) (5a. irudia). Emaitzek erakusten dute DARS-AS1-en kolpeak saguetan tumore-hazkundea izugarri murriztu zuela (p balioa < 0,0001) (5a. irudia). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значе,ни0 p. 10). Emaitzek erakusten dute DARS-AS1 knockdown-ek saguetan tumorearen hazkundea izugarri murrizten duela (p balioa < 0,0001) (5a irudia).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значительно снижает рост опухоли у мышей (зна 0.5). Emaitzek erakutsi zuten DARS-AS1 knockdown-ek saguetan tumorearen hazkundea nabarmen murriztu zuela (p balioa < 0,0001) (5a irudia).Horrela, DARS-AS1 knockdown taldean, tumorearen batez besteko bolumenaren % 72,9 inguru jaitsi zen eta tumorearen batez besteko masa % 87,8 inguru (5b-d irudia).Emaitza hauek biziki iradokitzen dute DARS-AS1-ek tumoreen hazkuntza in vivo nabarmen sustatu dezakeela.
Ad DARS-AS1 kolpearen ondorioak kolorektaleko onkogenesian sagu biluzietan.Hazkunde kurbak (a), tumorearen tamaina (b), pisua (c) eta tumoreen irudiak (d) erakusten dira.Errore-barrak ±SEM adierazten dute. n = 10. ****p < 0,0001, bi isatseko Student-en t testaren bidez. n = 10. ****p < 0,0001, bi isatseko Student-en t testaren bidez. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 bi isatseko Student-en t-testa.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 bi isatseko Student-en t-testa.Kaplan-Meierrek DARS-AS1 adierazpen-mailen eta biziraupen orokorraren arteko korrelazioa aztertu zuen UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM eta LGG duten pazienteetan.Pazienteetan DARS-AS1 adierazpen-maila altuak % 50en artean zeuden;pazienteetan DARS-AS1 adierazpen maila baxua beheko %50ean zegoen.p-balioak log rank test erabiliz zehaztu ziren.f DARS-AS1 PACT-PKR bidea eta tumore-hazkundea erregulatzen dituen eredua.
DARS-AS1-en eragin klinikoa hobeto ulertzeko, haren adierazpenaren eta pazientearen biziraupenaren arteko korrelazioa aztertu dugu.TCGA datu-multzoa aztertuta, DARS-AS1 espresio handiagoa ubeal melanomarekin (UVM), giltzurruneko kromofobiarekin (KICH), giltzurruneko zelula papilarren kartzinomarekin (KIRP), mesoteliomarekin (MESO), multiplexarekin lotzen zela aurkitu genuen.Biziraupen baxuagoa glioblastomaren morfosiarekin (GBM) eta garuneko glioma baxuko (LGG) duten pazienteekin (5e irudia).Emaitza hauek iradokitzen dute DARS-AS1ek tumore klinikoen progresioan paper garrantzitsua izan dezakeela eta minbizi anitzetan aurreikuspen biomarkatzaile potentziala izan daitekeela.
Ikerketa honetan, CRISPRi eskala handiko baheketa funtzionala erabiliz, DARS-AS1 lncRNA-k minbizi-zelulen estresa gainditzen duela zehaztu dugu, estresari erantzuteko bi funtsezko erantzule erregulatuz, PACT eta PKR.PACT-ekin zuzenean elkarreraginean, DARS-AS1-ek PACT bidezko PKR aktibazioa inhibitu zuen, horrela zelulen heriotza apoptotikoa saihestuz eta zelulen ugalketa sustatuz (5f. irudia).DARS-AS1-en gorako erregulazioa minbizi-mota askotan ikusi da, eta horrek iradokitzen du estres-baldintzetan minbizi-zelulen biziraupena sustatzeko duen funtzioa minbizi-mota askotan aplikagarria izan daitekeela.
PACT PKR proteina aktibatzaile gisa identifikatu da, eta PACT bidezko PKR aktibazioa estresaren erantzunetan paper garrantzitsua jokatzen du, transkripzioa, itzulpena, apoptosia eta beste prozesu zelula garrantzitsuak erregulatuz62.Hamarkadetan zehar, PACT-PKR kaskadaren minbiziari dagokion erregulazioa ulertzen saiatu dira.Hemen, gure ikerketak PACT-PKR minbizi-zeluletan erregulatzeko beste mekanismo bat agerian utzi du DARS-AS1 lncRNA zelularren bidez, PACT-ekin zuzenean lotzen dena, PACT-PKR elkarrekintza blokeatzen duena, PKR aktibazioa eta eIF2α fosforilazioa inhibitzen dituena, eta, ondorioz, estresak eragindako apoptosia inhibitzen du. minbiziaren ugaltzea suspertzea.zelulak.Aurkikuntza honek minbiziaren pronostikorako eta terapiarako lncRNA helburu potentzialak argitzen ditu.
Gure datuek erakutsi zuten DARS-AS1 knockdown-ek zelulak serum gosearen aurrean sentsibilizatzen dituela PKR fosforilatuaren eta eIF2α-ren hazkunde nabarmenarekin.Emaitza hauek iradokitzen dute DARS-AS1ek baldintza gogorretan minbizi-zelulen biziraupena sustatzen duela PACT/PKR jarduera inhibituz.Kodetzen ez diren beste hainbat RNAk, hala nola, ASPACT eta nc886, PACT/PKR ardatzean ere parte hartzen dute PACT48 mRNA beherago erregulatuz edo autofosforilazioa erregulatuz PKR49,50,64rekin lotuz.Horien artean, DARS-AS1 PACT-PKR elkartearen disruptore gisa jokatzen du.Ikerketa honek PACT/PKR ardatzaren erregulazioa eta lncRNA-ek estresaren erantzunetan duten eginkizuna aberasten du.
PACTek hiru domeinu bereizi ditu.Lehen bi dsRBD bakoitza nahikoa da PACT-ekin PKR-rekin lotzeko afinitate handia lortzeko, eta hirugarren domeinua (D3) beharrezkoa da PKR in vitro eta in vivo aktibatzeko.Gure ikerketak erakutsi zuen DARS-AS1-ek lehentasunez D3 domeinuarekin elkarreragiten duela (3h. irudia).LncRNA-ren (768 nukleotido) tamaina handia dela eta, DARS-AS1 D3-rekin lotzeak dsRBD eta PKR-ren PACT domeinuaren arteko elkarrekintza fisikoki galarazi dezake, eta horrela PACT eta PKR-en elkarketa blokeatzen du.D3n Ser246 eta Ser287 alanina edo aspartatoarekin ordezkatu zituzten PACT puntu-mutazioek DARS-AS1arekiko lotura-afintasuna eten zuten, D3-ren propietate estruktural eta elektriko orokorrak haien elkartean duten garrantzia adieraziz.Etorkizunean mekanismo honen xehetasun gehiago beharko dira, analisi biokimiko zehatzagoak eta bereizmen handiko PACT egiturazko analisiak erabiliz.
Aurretik egindako ikerketek jakinarazi dute DARS-AS1-ek zelulen ugalketa sustatzen duela hainbat mekanismoren bidez51,52,53.Adibide batean, ikertzaileek ikusi zuten DARS-AS1-ek bere zentzuaren aurkako proteina kodetzen duen DARS genea erregulatzen zuela miP-194-5p giltzurruneko minbizi-zeluletan bideratuz.Hala ere, ikerketa honetan, DARS-AS1 knockdown-ek eragin txikia izan zuen DARSen transkripzioan minbizi mota anitzetan, gutxienez koloneko, bularreko eta gibeleko minbizietan.LncRNA-ek zelulen eta ehunen espresio-eredu espezifikoak erakusten dituztenez, baliteke mekanismo funtzionalak ez izatea minbizi mota guztietan, eta horrek gure behaketen eta minbizi ezberdinen aurreko ebaluazioen arteko desadostasun hori lagun dezake.Azterketa bereziak behar dira hainbat prozesu fisiologiko eta patologikoren mekanismo espezifikoak argitzeko.
Datu klinikoen azterketa batek erakutsi du tumoreetan DARS-AS1 adierazpena alderantziz erlazionatuta dagoela minbizi-gaixoen biziraupenarekin, eta horrek azpimarratzen du DARS-AS1/PACT/PKR ardatzak minbiziaren pronostikoan duen garrantzia.Amaitzeko, gure ikerketak erakusten du DARS-AS1 PACT/PKR seinaleztapen-ardatzaren erregulatzailea dela, minbizi-zelulen ugalketa sustatzen duela eta estresaren erantzunean apoptosia inhibitzen duela, eta horrek beste ikerketa-lerro bat eskaintzen du eta etorkizuneko tratamendu potentzialen ikerketarako interesgarria dela. .
SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 eta HEK293T giza zelula-lerroak Txinako National Cell Line Resource Infrastructuretik lortu ziren.Zelula guztiak DMEM medioan (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) % 10eko FBS (Gemini, Brooklyn, NY) eta % 1 penizilina-estreptomizina (Thermo Fisher Scientific) 37 °C-tan, % 5 CO2rekin osatuta mantendu ziren.inkubagailua.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Bandera, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosforoa S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosforoa S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulina, CST (2128);saguaren IgG normala, CST (5415S);untxi IgG normala, CST (2729S).Antigorputzak 1:1000 PBSTn diluitu ziren Western blotting-erako eta 1:100 IPrako.
sgRNAk CRISPR-ERA66 izeneko tresna publikoa erabiliz garatu ziren.sgRNA garatzeko tresnaren parametro lehenetsiak erabili ditugu eta algoritmoak sgRNA lotzeko guneak 3 kb-ko eskualdean kalkulatu ditu.TSSn zentratua.SgRNA oligonukleotidoen multzoak sintetizatu ziren CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) eta pgRNA plasmido humanizatuetan klonatu ziren (Addgene #44248).Guztira, 12 µg pgRNA plasmido humanizatu batu, 7,2 µg psPAX2 (Addgene #12260) eta 4,8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 106 HEK293T-n kotransfektatu ziren 10 cm-ko DNA transfekzioko erreaktiboa erabiliz. zelulak (CWBIO, Beijing, Txina) fabrikatzailearen argibideak jarraituz.Birusak dituzten gainnatzaileak transfekzioaren ondoren 48 eta 72 ordura bildu eta 0,45 µm-ko iragazki batetik iragazi ziren.Baheketa egiteko, dCas9/KRAB fusio-proteina adierazten duten SW620 zelulak lortu ziren birusen transdukzioz.Aldatutako SW620 zelulak birusen liburutegiarekin infektatu ziren lau infekzio-esperimentu independenteetan 0,1-0,3 MOI-n eta 2 μg/ml puromizinarekin (Sigma, St. Louis, MO) lagintu ziren 2 egunez.Hortik aurrera, zelulak 18 egunez hazi ziren in vitro 500 zelula/sgRNA-ko liburutegiko gutxieneko estaldurarekin baheketa egiteko.
DNA genomikoa QIAamp DNA Blood Midi Kit-aren jarraibideen arabera atera zen (QIAGEN, Düsseldorf, Alemania; 51183).Guztira, 100 μg DNA genomikoaren errepikapen biologiko bakoitzeko erabili zen liburutegia eraikitzeko.SgRNA eskualdea PCR bi txandaren bidez anplifikatu zen eta barra-kode bati lotu zen.
PCR produktuak NucleoSpin® gel eta PCR arazketa-kit erabiliz araztu ziren (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemania; 740609.250) eta Qubit™ HS hari bikoitzeko DNA detektatzeko kitarekin (Thermo Fisher Scientific; Q32854) kuantifikatu ziren.
MTS saiakera zelularen ugalketa neurtzeko erabili zen.Zelulak 96 putzuko plaketan hazi ziren 2000 zelula/putzu hasierako dentsitatearekin.Zelula kopuru erlatiboa egunero neurtu zen adierazitako orduan 4-6 egun guztira.Putzu bakoitzeko, 20 μl MTS erreaktibo (Promega) 100 μl DMEMrekin diluitu ziren, zelulekin 4 orduz inkubatu zen 37 °C-tan, eta ondoren OD490 neurtu zen.
Ainguratu gabeko hazkuntzarako gaitasuna esferen eraketa aztertuta aurkitu zen.Laburbilduz, shRNA DARS-AS1 edo kontrol shRNArekin transfektatutako 2000 zelula atxikimendu ultra baxuko mikroplaketan (Corning) hazi ziren 4 egunez behin ertain aldaketarekin.Esferoideak 14 egun igaro ondoren zenbatu ziren.DARS-AS1 gainespresio-plasmidoarekin edo kontrol-plasmido batekin transfektatutako 500 zelula erabili ziren hobekuntza-saiakuntzarako, bestela metodoa ez zen aldatu.
RNA T7 RNA polimerasa eta biotina-16-UTP (Roche 1138908910) erabiliz transkribatu zen Riboprobe® Combination Systems-en (Promega P1440) jarraibideen arabera.Hemen erabiltzen diren lehengaiak 4. taula osagarrian zerrendatzen dira.
Proteinak kodetzen dituzten PACT edo PKR eskualdeak pET15b-n klonatu ziren (Addgene #73619) eta BL21(DE3) bihurtu ziren.Bakterioak gau osoan inkubatu ziren anpizilinaz hornitutako LBn eta gero 100 aldiz diluitu ziren LB freskoarekin.Erdikoaren OD600 0,8ra iritsi zenean, 1 mM IPTG gehitu zen proteina adierazpena eragiteko.Gauean inkubatu ondoren astindu leunarekin (250 rpm 20 °C-tan), zelula pelleta zentrifugazio bidez bildu zen (4000 rpm, 10 min, 4 °C).Suspendu zelula-pelleta lisi-tampon (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) eta izotzetan inkubatu 30 minutuz, ondoren sonikatu (15 min, 5 s piztu/itzali, izotzean) eta zentrifugatu (13.000). rpm)., 30 min, 4°С).Gain-nadantea Ni-NTA erretxinan (QIAGEN) 3 aldiz kargatu zen 4 °C-tan, 4 aldiz garbitu zen garbiketa tamponarekin (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCl) eta 3 aldiz eluitu zen, guztira. 10 ml-ko eluante-tampon (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazol).Purifikatutako proteina WB erabiliz zehaztu zen eta kontzentrazioa Qubit™ proteina entsegu-kitarekin (Thermo Fisher Scientific; Q 33212) zehaztu zen.
RIP entseguak lehen deskribatu bezala egin ziren, aldaketekin.Laburbilduz, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin erribonukleasa inhibitzailea (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteasa) koktel zitostatikoa 1 x 107 lisatzen du. (Roche, 1 mM DTT) eta zentrifugatu 13.000 rpm-an 15 minutuz 4 °C-tan.Ondoren, gainnatzailea A+G proteina ale magnetikoekin (Millipore) inkubatu zen 5 μg anti-PACT antigorputz (Abeam) edo IgG (CST) batekin konjugatuta.Aleak 5 aldiz garbitu ziren 5x RIP bufferarekin, ondoren K proteinasarekin (NEB) digeritu.RNA Trizolarekin atera eta RT-qPCR bidez zehaztu zen.Lehenak 5. taula osagarrian aurkezten dira.
In vitro RIP saiakuntza RIP saiakuntza estandar aldatutako protokolo baten arabera egin da.Guztira 5 pmol in vitro transkribatutako RNA 1 aldiz diluitu ziren RIP bufferarekin eta 65 ° C-tan inkubatuz 5 minutuz eta ondoren giro-tenperaturara motel hoztu zen.Bandera markadun PACT proteina osorik edo mutatutako 5 pmol guztira araztu ziren E. colitik.Inkubatu ARN birnaturalarekin 2 orduz 4 °C-tan eta jarraitu goiko prozedurari banderaren aurkako IPrako RIP azterketarako.
RNA hedapena aztertzeko, 1 × 107 zelula lisatu ziren 1xRIP bufferarekin.13.000 rpm zentrifugazioan 15 minutuz 4 °C-tan, gainnatzailea aldez aurretik tratatu zen 30 μl estreptavidin ale magnetikoekin (Beckman) 2 orduz 4 °C-tan.Ondoren, araztutako lisatua legamia tRNArekin hornitu zen eta 40 pmol birnaturalizatutako RNArekin inkubatu zen gauean 4 ° C-tan, gero beste 2 orduz eta BSArekin blokeatutako streptavidin ale magnetiko berrien 20 μl gehitu ziren.Garbiketa urratsa 4 aldiz izan zen 5x RIP bufferarekin eta 4 aldiz 1x RIP bufferarekin.Dagozkion proteinak biotina eluzio-bufferrekin (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotina, PMSF) eluitu ziren eta NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gelan (Invitrogen) bereizi ziren.Zilarrezko tindaketaren ondoren (Beyotime Biotechnology), zenbait banda kendu eta analizatu ziren MS-k.
Co-IP azterketa egin zen PACT eta PKRren arteko elkarrekintza probatzeko.Laburbilduz, lisatu gainditzaileak prestatu ziren 1 x 107 zelula lisatu 1 x RIP buffer batean inkubatuz eta 13.000 rpm-an zentrifugatuz 15 minutuz 4 ° C-tan.Lisateak proteina A + G ale magnetikoekin kargatu ziren, PACTaren aurkako 5 µg antigorputzarekin konjokatu eta gau osoan zehar biratu ziren 4 °C-tan.Aleak 3 aldiz garbitu ziren 5 × RIP bufferarekin, bi aldiz 1 × RIP bufferarekin eta 1 × SDS bufferarekin eluitu ziren.Berreskuratutako proteina SDS-PAGE gelaren bidez aztertu eta WBk detektatu zen.
PACT markatuaren bi pmol eta PKR 1 pmol araztu ziren E. colitik.Diluitu 1 × RIP buffer batean eta inkubatu 10 pmol RNA birrinduarekin 2 orduz 4 °C-tan.Horren ostean, A+G proteina magnetikoarekin etiketatutako antigorputz konjokatuarekin inkubatu ziren bi ordu gehiagoz.Aleak lau aldiz garbitu ziren 1x RIP bufferarekin eta 1x SDS tamponarekin eluitu ziren.Ondorioz, PACT eta PKR detektatu zituen WBk.