Berriak

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Fotosensibilizatzaile eraginkorrak bereziki garrantzitsuak dira fototerapiaren erabilera kliniko zabalerako.Hala ere, ohiko fotosensibilizatzaileek, oro har, uhin-luzera laburren xurgapena, nahikoa fotoegonkortasuna, oxigeno-espezie erreaktiboen (ROS) errendimendu kuantiko baxua eta agregazioek eragindako ROSen itzaltzea pairatzen dute.Hemen infragorri hurbileko (NIR) fotosensibilizatzaile supramolekularra (RuDA) baten berri ematen dugu Ru(II)-areno konplexu organometalikoen auto-muntaketaren bidez ur-soluzioetan.RuDAk oxigeno singletea (1O2) agregatu-egoeran soilik sor dezake, eta agregazio-induzitutako 1O2 sorrerako portaera nabaria du, singlete-hirukote sistemaren arteko gurutzaketa-prozesua nabarmen handitu delako.808 nm-ko laser argiaren eraginez, RuDAk %16,4ko 1O2 etekin kuantikoa erakusten du (FDAk onartutako indoziano berdea: ΦΔ=0,2%) eta %24,2ko bihurtze fototermikoko eraginkortasun handia (urrezko nanorod komertzialak) fotoegonkortasun bikainarekin.: % 21,0, urrezko nanoshellak: % 13,0).Gainera, biobateragarritasun ona duten RuDA-NP-ak tumore-guneetan metatu daitezke lehentasunez, terapia fotodinamikoan zehar tumoreen erregresio garrantzitsua eraginez, in vivo tumore-bolumena % 95,2 murriztuz.Agregazioa hobetzen duen terapia fotodinamiko honek propietate fotofisiko eta fotokimiko onak dituzten fotosensibilizatzaileak garatzeko estrategia eskaintzen du.
Terapia konbentzionalarekin alderatuta, terapia fotodinamikoa (PDT) minbiziaren aurkako tratamendu erakargarria da bere abantaila esanguratsuengatik, hala nola kontrol espazio-denbora zehatza, inbaditzaile eza, botiken erresistentzia arbuiagarria eta bigarren mailako efektuen minimizazioa 1,2,3.Argiaren irradiaziopean, erabilitako fotosensibilizatzaileak aktibatu daitezke oxigeno-espezie oso erreaktiboak (ROS) sortzeko, apoptosia/nekrosia edo erantzun immunologikoak eraginez4,5. Hala ere, ohiko fotosensibilizatzaile gehienek, hala nola, kloroak, porfirinak eta antrakinonak, uhin-luzera laburreko xurgapena dute (maiztasuna < 680 nm), eta, ondorioz, argiaren sartze eskasa eragiten dute, molekula biologikoen (adibidez, hemoglobina eta melanina) xurgapen bizia delako. ikusgai dagoen eskualdea6,7. Hala ere, ohiko fotosensibilizatzaile gehienek, hala nola, kloroak, porfirinak eta antrakinonak, uhin-luzera laburreko xurgapena dute (maiztasuna < 680 nm), eta, ondorioz, argiaren sartze eskasa eragiten dute, molekula biologikoen (adibidez, hemoglobina eta melanina) xurgapen bizia delako. ikusgai dagoen eskualdea6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Hala ere, kloroak, porfirinak eta antrakinonak bezalako fotosensibilizatzaile ohikoenek uhin-luzera xurgatze nahiko laburra dute (< 680 nm), eta ondorioz, argiaren barneratze eskasa da molekula biologikoen xurgapen bizia (adibidez, hemoglobina eta melanina) eskualde ikusgaian6,7.然而, 大多数 传统 的 光敏剂, 如 二 氢 卟酚, 卟啉 和 蒽醌, 具有 相对 较 短 的 波长 相对 (频率 <680 nm), 因此 由于 对 生物 分子 (如 由于 对 和 生物 分子) 的 强烈 吸收,导致光穿透性差。然而, 大多数 传统 的 光敏剂, 二 氢 卟酚, 卟啉 蒽醌, 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 (频率 频率 <680 nm) 因此 由于 对 分子 (血红 对 和 分子) 的 ,,,, 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Hala ere, kloroak, porfirinak eta antrakinonak bezalako fotosensibilizatzaile tradizional gehienek uhin-luzera xurgatze nahiko laburra dute (maiztasuna < 680 nm) biomolekularen xurgapen handia dela eta, hemoglobina eta melanina bezalako biomolekulak xurgapen handia dutelako, eta ondorioz, argiaren sartze eskasa da.Ikusgai dagoen eremua 6.7.Hori dela eta, 700-900 nm-ko "leiho terapeutikoan" aktibatzen diren fotosensibilizatzaileak xurgatzen dituzten infragorri hurbilak (NIR) egokiak dira fototerapiarako.Infragorri hurbileko argia ehun biologikoek gutxien xurgatzen dutenez, sartze sakonagoa eta fotokalte gutxiago ekar dezake8,9.
Zoritxarrez, NIR xurgatzen duten fotosensibilizatzaileek, oro har, fotoegonkortasun eskasa dute, oxigeno singlet (1O2) sortzeko ahalmen baxua eta agregazioak eragindako 1O2 itzaltzea, eta horrek aplikazio klinikoa mugatzen du10,11.Ohiko fotosensibilizatzaileen propietate fotofisiko eta fotokimikoak hobetzeko ahalegin handiak egin badira ere, orain arte hainbat txostenek jakinarazi dute NIR xurgatzen duten fotosensibilizatzaileek arazo horiek guztiak konpondu ditzaketela.Horrez gain, hainbat fotosensibilizatzaileek 1O212,13,14 eraginkortasunez sortzeko itxaropena erakutsi dute 800 nm-tik gorako argiarekin irradiatzen direnean, fotoiaren energia azkar gutxitzen baita IR inguruko eskualdean.Trifenilamina (TFA) elektroi-emaile gisa eta [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazina (TDP) elektroi-hartzaile talde gisa Emaile-onartzaile (DA) motako koloratzaileak klase bat dira. koloratzaileen , infragorri hurbila xurgatzen dutenak, infragorri hurbileko bioirudi II eta terapia fototermikorako (PTT) oso aztertuak izan diren banda-hutsaren ondorioz.Hortaz, DA motako koloratzaileak erabil daitezke IR hurbileko kitzikapenarekin PDTrako, nahiz eta oso gutxitan aztertu diren PDTrako fotosensibilizatzaile gisa.
Jakina da fotosensibilizatzaileen arteko gurutzaketaren (ISC) eraginkortasun handiak 1O2-aren sorrera bultzatzen duela.ISC prozesuan aurrera egiteko estrategia arrunt bat fotosensibilizatzaileen spin-orbita akoplamendua (SOC) hobetzea da, atomo astunak edo zati organiko bereziak sartuz.Hala ere, ikuspegi honek desabantaila eta muga batzuk ditu oraindik19,20.Berriki, auto-muntatze supramolekularrak behetik gorako ikuspegi adimentsua eskaini du maila molekularrean material funtzionalak fabrikatzeko,21,22 abantaila ugarirekin fototerapian: (1) auto-muntatutako fotosensibilizatzaileek zinta-egiturak osatzeko ahalmena izan dezakete.Eraikuntza-blokeen arteko orbitak gainjartzen direlako energia-mailen banaketa trinkoagoa duten egitura elektronikoen antzekoa.Hori dela eta, beheko singletearen egoera kitzikatuaren (S1) eta ondoko hirukotearen egoera kitzikatuaren (Tn) arteko energia parekatzea hobetuko da, eta hori onuragarria da ISC prozesurako 23, 24 .(2) Muntaketa supramolekularrak erlaxazio ez-erradiatiboa murriztuko du mugimendu intramolekularra mugatzeko mekanismoan (RIM) oinarrituta, ISC prozesua ere sustatzen duena 25, 26.(3) Multzo supramolekularrak monomeroaren barruko molekulak oxidaziotik eta degradaziotik babestu ditzake, eta, ondorioz, fotosentizatzailearen fotoegonkortasuna asko hobetzen du.Aurreko abantailak kontuan hartuta, uste dugu fotosensibilizatzaile supramolekularren sistemak alternatiba itxaropentsua izan daitekeela PDTaren gabeziak gainditzeko.
Ru(II)-n oinarritutako konplexuak gaixotasunen diagnostiko eta terapiarako balizko aplikazioetarako plataforma mediko itxaropentsua dira, propietate biologiko berezi eta erakargarriengatik28,29,30,31,32,33,34.Horrez gain, egoera kitzikatuen ugaritasunak eta Ru(II) oinarritutako konplexuen propietate fotofisikokimiko sintonizagarriek abantaila handiak eskaintzen dituzte Ru(II) oinarritutako fotosensibilizatzaileen garapenerako35,36,37,38,39,40.Adibide aipagarri bat TLD-1433 rutenio(II) polipiridil konplexua da, gaur egun II faseko saiakuntza klinikoetan dagoena, maskuriko minbizi ez-inbaditzailea ez den muskulu-inbaditzailea (NMIBC) tratatzeko fotosensibilizatzaile gisa41.Horrez gain, rutenio(II)areno konplexu organometalikoak asko erabiltzen dira minbiziaren tratamendurako agente kimioterapeutiko gisa, toxikotasun baxua eta aldatzeko erraztasunagatik42,43,44,45.Ru(II)-areno konplexu organometalikoen propietate ionikoek DA kromoforoen disolbagarritasun eskasa hobetu dezakete disolbatzaile arruntetan, baizik eta DA kromoforoen muntaia hobetu.Horrez gain, Ru(II)-arenoen konplexu organometalikoen egitura pseudooktaedrikoak DA motako kromoforoen H-agregazioa eragotzi dezake, eta horrela, gorrira desplazatutako xurgapen-bandekin J-agregazioa sortzea errazten du.Hala ere, Ru(II)-areno konplexuen berezko desabantailek, egonkortasun baxua eta/edo biodisponibilitate eskasa, esaterako, areno-Ru(II) konplexuen eraginkortasun terapeutikoan eta in vivo jardueran eragina izan dezakete.Hala ere, ikerketek frogatu dute desabantaila horiek gaindi daitezkeela polimero biobateragarriekin rutenio konplexuak kapsulatuz kapsulatze fisikoaren edo konjugazio kobalentearen bidez.
Lan honetan, Ru(II)-areno (RuDA) DA-konjugatutako konplexuen berri ematen dugu NIR abiarazlea duten DAD kromoforoaren eta Ru (II)-areno zatiaren arteko koordinazio-lotura baten bidez.Sortzen diren konplexuak auto-bildu daitezke uretako besikula metalosupramolekularretan, elkarrekintza ez-kobalenteen ondorioz.Nabarmentzekoa, muntaketa supramolekularrak RuDA polimerizazioak eragindako sistema arteko gurutzaketa-propietateez hornitu zuen, eta horrek ISC eraginkortasuna nabarmen handitu zuen, PDTrako oso mesedegarria zena (1A. irudia).Tumoreen metaketa eta in vivo biobateragarritasuna areagotzeko, FDAk onartutako Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) RuDA47,48,49 kapsulatzeko erabili zen RuDA-NP nanopartikulak sortzeko (1B irudia) PDT / Dual- modu eraginkorrean jokatzen zutenak. modua PTT proxy .Minbiziaren fototerapian (1C irudia), RuDA-NP sagu biluziak MDA-MB-231 tumoreekin tratatzeko erabili zen PDT eta PTT-en eraginkortasuna in vivo aztertzeko.
RuDAren mekanismo fotofisikoaren ilustrazio eskematikoa minbiziaren fototerapiarako forma monomeriko eta agregatuetan, B RuDA-NP eta C RuDA-NP-en sintesia NIR-ak aktibatutako PDT eta PTTrako.
RuDA, TPA eta TDP funtzionalitatez osatutakoa, 1. irudi osagarrian (2A irudia) erakusten den prozeduraren arabera prestatu zen, eta RuDA 1H eta 13C RMN espektroak, elektrospray ionizazio-masa espektrometria eta analisi elementala (2-4 irudi osagarriak) ezaugarritu zituen. ).Singlet trantsizio baxuenaren RuDA elektroi-dentsitate-diferentzia-mapa denboraren araberako dentsitate-teoria funtzionalaren bidez (TD-DFT) kalkulatu zen karga-transferentzia prozesua aztertzeko.5. irudi osagarrian ikusten den bezala, elektroi-dentsitatea batez ere trifenilaminatik TDP hartzailera pasatzen da fotoekzitazioaren ondoren, eta hori karga barneko molekula-transferentzia (CT) trantsizio tipiko bati egotz daiteke.
Mineralaren egitura kimikoa B. Mineralaren xurgapen-espektroak DMF eta uraren proportzio ezberdinen nahasketetan.C RuDA (800 nm) eta ICG (779 nm) xurgapen balio normalizatuak 808 nm-ko laser argiaren 0,5 W cm-2 denboraren aldean.D ABDAren fotodegradazioa 808 nm-ko uhin-luzera eta 0,5 W/cm2-ko potentzia duten laser-erradiazioaren eraginpean DMF/H2O nahasketetan 1O2 eraketaz adierazten da.
Laburpena: UV-ikuspegiko xurgapen espektroskopia erabili zen DMFren eta uraren nahasteetan Orearen auto-muntatze-propietateak hainbat ratiotan aztertzeko.irudian ikusten den bezala.2B, RuDAk 600 eta 900 nm arteko xurgapen-bandak erakusten ditu DMFn, 729 nm-ko gehienezko xurgapen-bandarekin.Ur-kantitatea handitzeak Ore xurgapen maximoa 800 nm-ra pixkanaka gorrira aldatzea ekarri zuen, eta horrek sistema muntatutako Orearen J-agregazioa adierazten du.Disolbatzaile desberdinetan RuDAren fotolumineszentzia espektroak 6. irudi osagarrian erakusten dira. Badirudi RuDAk NIR-II lumineszentzia tipikoa erakusten duela igorpenaren uhin-luzera maximoarekin.1050 nm CH2Cl2 eta CH3OHn, hurrenez hurren.RuDAren Stokes-en desplazamendu handiak (300 nm inguru) egoera kitzikatuaren geometrian aldaketa nabarmena eta energia baxuko egoera kitzikatuen eraketa adierazten du.Orearen lumineszentzia kuantikoak CH2Cl2 eta CH3OH-n % 3,3 eta 0,6 direla zehaztu zen, hurrenez hurren.Hala ere, metanol eta uraren nahasketa batean (5/95, v/v), igorpenaren gorrira desplazamendu apur bat eta etekin kuantikoaren jaitsiera (% 0,22) antzeman ziren, eta hori Orearen auto-muntaketaren ondorioz izan daiteke. .
OREaren auto-muntaketa ikusteko, indar atomiko likidoaren mikroskopia (AFM) erabili dugu, ura gehitu ondoren metanol-disoluzioan ORE-ren aldaketa morfologikoak ikusteko.Ur-edukia % 80tik beherakoa zenean, ez zen agregazio argirik ikusi (7. irudi osagarria).Hala ere, ur-edukia %90-95era arte areagotu zenean, nanopartikula txikiak agertu ziren, eta horrek Ore-ren auto-muntaketa adierazten zuen. Gainera, 808 nm-ko uhin-luzera duen laser-irradiazioak ez zuen RuDAren xurgapen-intentsitatean eraginik izan uretan. soluzioa (2C irudia eta 8. irudi osagarria).Aitzitik, indozianina berdearen (ICG kontrol gisa) xurgapena azkar jaitsi zen 779 nm-tan, RuDAren fotoegonkortasun bikaina adieraziz.Horrez gain, RuDA-NPen egonkortasuna PBSn (pH = 5,4, 7,4 eta 9,0), 10% FBS eta DMEM (glukosa altua) UV-ikuspegiko xurgapen espektroskopiaz aztertu zen hainbat puntutan.9. irudi osagarrian ikusten den bezala, RuDA-NP xurgapen bandeetan aldaketa txikiak ikusi ziren PBSn pH 7.4/9.0, FBS eta DMEM-n, RuDA-NP-ren egonkortasun bikaina adieraziz.Hala ere, medio azido batean (рН = 5,4) Mearen hidrolisia aurkitu zen.RuDA eta RuDA-NPren egonkortasuna ere ebaluatu dugu errendimendu handiko kromatografia likidoaren (HPLC) metodoak erabiliz.10. irudi osagarrian erakusten den bezala, RuDA egonkorra izan zen metanol eta uraren nahasketa batean (50/50, v/v) lehen orduan, eta hidrolisia ikusi zen 4 orduren buruan.Hala ere, gailur ahur-ganbil zabal bat bakarrik ikusi zen RuDA NPentzat.Hori dela eta, gel-permeation kromatografia (GPC) erabili zen RuDA NPen egonkortasuna PBSn (pH = 7,4) ebaluatzeko.11. Irudi osagarrian erakusten den moduan, probatutako baldintzetan 8 ordu inkubatu ondoren, NP RuDAren gailurraren altuera, gailurraren zabalera eta gailurraren eremua ez ziren nabarmen aldatu, NP RuDAren egonkortasun bikaina adieraziz.Horrez gain, TEM irudiek erakutsi zuten RuDA-NP nanopartikulen morfologia ia aldatu gabe geratzen zela 24 ordu igaro ondoren PBS buffer diluituan (pH = 7.4, 12. irudi osagarria).
Auto-muntaketak ezaugarri funtzional eta kimiko desberdinak eman diezazkiokeelako Oreari, metanol-ur nahasteetan 9,10-antrazenediilbis(metileno)dimaloniko azidoa (ABDA, 1O2 adierazlea) askatzen dela ikusi dugu.Ur-eduki ezberdineko mea50.2D irudian eta 13. irudi osagarrian erakusten den moduan, ez zen ABDAren degradaziorik ikusi uraren edukia % 20tik behera zegoenean.Hezetasuna %40ra igo zenean, ABDA degradazioa gertatu zen, ABDA fluoreszentziaren intentsitatearen jaitsierak frogatzen duenez.Era berean, ikusi da ur eduki handiagoak degradazio azkarragoak eragiten dituela, RuDA auto-muntatzea beharrezkoa eta onuragarria dela ABDA degradatzeko.Fenomeno hau ACQ (aggregation-induced quenching) kromoforo modernoetatik oso desberdina da.808 nm-ko uhin-luzera duen laser batekin irradiatzen denean, 1O2 RuDAren etekin kuantikoa % 98 H2O/2 % DMF nahasketa batean % 16,4 da, hau da, ICGrena baino 82 aldiz handiagoa (ΦΔ = % 0,2)51, agregazio-egoeran 1O2 RuDA sorkuntza-eraginkortasun nabarmena erakutsiz.
2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona (TEMP) eta 5,5-dimetil-1-pirrolina N-oxidoa (DMPO) spin-tranpa gisa 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinona erabiliz elektroien biraka, ondoriozko espezieak identifikatzeko, erresonantzia espektroskopia (ESR) erabili zen. AFK.RuDAren eskutik.14. irudi osagarrian erakusten den moduan, 0 eta 4 minutu arteko irradiazio-denboretan 1O2 sortzen dela baieztatu da.Horrez gain, RuDA irradiaziopean DMPOarekin inkubatu zenean, 1:2:2:1 DMPO-OH· aduktuaren lau lerroko EPR seinale tipikoa detektatu zen, hidroxilo erradikalen (OH·) eraketa adieraziz.Oro har, goiko emaitzek frogatzen dute RuDAk ROS ekoizpena suspertzeko duen gaitasuna, I/II motako fotosentsibilitate prozesu bikoitz baten bidez.
RuDAren propietate elektronikoak forma monomerikoetan eta agregatuetan hobeto ulertzeko, RuDAren mugako orbital molekularrak forma monomerikoetan eta dimerikoan kalkulatu ziren DFT metodoaren bidez.irudian ikusten den bezala.3A, RuDA monomerikoaren orbital molekularrik altuena (HOMO) deslokalizatuta dago ligandoaren bizkarrezurran zehar eta okupatu gabeko orbital molekularrik baxuena (LUMO) TDP hartzaileen unitatean zentratuta dago.Aitzitik, HOMO dimerikoaren elektroi-dentsitatea RuDA molekula baten ligandoan kontzentratzen da, eta LUMOko elektroi-dentsitatea, batez ere, beste RuDA molekula baten hartzailean, eta horrek RuDA dimeroan dagoela adierazten du.CTren ezaugarriak.
A Orearen HOMO eta LUMO forma monomeriko eta dimerikoetan kalkulatzen dira.B Orearen singlet eta hirukote energia-mailak monomeroetan eta dimeroetan.C RuDA eta ISC kanal posibleen maila estimatuak C monomeriko eta D dimeriko gisa. Geziek ISC kanal posibleak adierazten dituzte.
RuDAren energia baxuko singlete-egoeretan elektroien eta zuloen banaketa forma monomeriko eta dimerikoetan Multiwfn 3.852.53 softwarearen bidez aztertu da, TD-DFT metodoa erabiliz kalkulatu direnak.Etiketa osagarrian adierazten den bezala.1-2 Irudietan erakusten den moduan, RDA zulo monomerikoak gehienbat ligando-bizkarrezurrean deslokalizatuta daude egoera kitzikatu hauetan, elektroiak gehienbat TDP taldean kokatzen diren bitartean, CT-ren ezaugarri intramolekularrak erakutsiz.Gainera, egoera kitzikatu singlete horietarako, zuloen eta elektroien arteko gainjartze gehiago edo gutxiago dago, eta horrek kitzikapen lokaletik (LE) ekarpenen bat egiten duela iradokitzen du.Dimeroetarako, molekula barneko CT eta LE ezaugarriez gain, molekularteko CT ezaugarrien proportzio jakin bat ikusi zen dagozkien egoeratan, batez ere S3, S4, S7 eta S8, CT intermolekularraren analisian oinarrituta, CT arteko trantsizio molekularrak nagusitzat hartuta. (Taula osagarria).3).
Emaitza esperimentalak hobeto ulertzeko, RuDA egoera kitzikatuen propietateak gehiago aztertu ditugu monomeroen eta dimeroen arteko desberdintasunak aztertzeko (4-5 taula osagarriak).3B irudian ikusten den bezala, dimeroaren egoera kitzikatuko singlete eta hirukoteen energia-mailak monomeroarenak baino askoz trinkoagoak dira, eta horrek S1 eta Tn-ren arteko energia-hutsunea murrizten laguntzen du. Jakinarazi denez, ISC trantsizioak energia-hutsune txikian (ΔES1-Tn < 0,3 eV) gauzatu daitezke S1 eta Tn54 artean. Jakinarazi da ISC trantsizioak S1 eta Tn54 arteko energia-hutsune txiki batean (ΔES1-Tn < 0,3 eV) barruan gauzatu daitezkeela. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энербольшой энергетой энергетой энергетой энергетич. S1 eta Tn54 arteko energia-hutsune txiki baten barruan (ΔES1-Tn <0,3 eV) ISC trantsizioak gauzatu daitezkeela jakinarazi da.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетой энергетой энергетой энергетич 1.зован Jakinarazi da ISC trantsizioa S1 eta Tn54 arteko energia-hutsune txiki baten barruan gauza daitekeela (ΔES1-Tn < 0,3 eV).Horrez gain, orbital bakarrak, okupatuta edo okupatuta ez daudenak, lotu singlete eta hirukote egoeretan desberdina izan behar du zero ez den SOC integrala emateko.Horrela, kitzikapen-energiaren eta trantsizio orbitalaren analisian oinarrituta, ISC trantsizioaren kanal posible guztiak erakusten dira.3C,D.Nabarmentzekoa, monomeroan ISC kanal bakarra dago eskuragarri, eta forma dimerikoak ISC trantsizioa hobetu dezaketen lau ISC kanal ditu.Horregatik, zentzuzkoa da RuDA molekula zenbat eta gehiago agregatu, orduan eta eskuragarriagoak izango direla ISC kanalak.Hori dela eta, RuDA agregatuek bi bandako egitura elektronikoak era ditzakete singlete eta hirukote egoeretan, S1 eta eskuragarri dagoen Tn-ren arteko energia-hutsunea murriztuz, ISCren eraginkortasuna areagotuz 1O2 sortzea errazteko.
Azpiko mekanismoa gehiago argitzeko, areno-Ru(II) konplexuaren (RuET) erreferentziazko konposatu bat sintetizatu genuen bi etil talde bi trifenilamina fenilo talderekin RuDAn ordezkatuz (4A. irudia, karakterizazio osoa lortzeko, ikus ESI, 15. osagarria). -21 ) Emailetik (dietilamina) hartzailera (TDF), RuET-k RuDAren CT intramolekularren ezaugarri berdinak ditu.Espero bezala, DMF-n RuET-en xurgapen-espektroak energia baxuko karga-transferentzia-banda erakutsi zuen infragorri hurbileko eskualdean 600-1100 nm-ko eskualdean xurgapen indartsuarekin (4B. irudia).Horrez gain, RuET agregazioa ur-edukia gero eta handiagoarekin ere ikusi zen, eta hori xurgapen maximoaren gorri-lehiaketan islatu zen, eta hori AFM irudi likidoaren bidez baieztatu zen (22. irudi osagarria).Emaitzek erakusten dute RuETek, RuDAk bezala, molekula barneko egoerak sor ditzakeela eta egitura agregatuetan auto-muntatu ditzakeela.
RuET-en egitura kimikoa.B RuET-en xurgapen-espektroak DMFren eta uraren proportzio ezberdinen nahasketetan.RuDA eta RuETrako C EIS Nyquist lursailak.RuDA eta RuET-en D fotokorronteen erantzunak 808 nm-ko uhin-luzera duen laser erradiazioen eraginez.
RuET-en aurrean ABDAren fotodegradazioa 808 nm-ko uhin-luzera duen laser batekin irradiazio bidez ebaluatu zen.Harrigarria bada ere, ez zen ABDAren degradaziorik ikusi hainbat ur-frakziotan (23. irudi osagarria).Arrazoi posible bat da RuET-ek ezin duela modu eraginkorrean osatu banda-egitura elektroniko bat, etil-kateak ez duelako molekula arteko karga-transferentzia eraginkorra sustatzen.Hori dela eta, inpedantzia elektrokimikoko espektroskopia (EIS) eta fotokorronte iragankorreko neurketak egin ziren RuDA eta RuETen propietate fotoelektrokimikoak alderatzeko.Nyquist grafikoaren arabera (4C irudia), RuDAk RuET baino erradio askoz txikiagoa erakusten du, hau da, RuDA56-k elektroi molekularraren arteko garraio azkarragoa eta eroankortasun hobea duela esan nahi du.Horrez gain, RuDAren fotokorronte dentsitatea RuETena baino askoz ere handiagoa da (4D. irudia), RuDA57-ren karga transferentziaren eraginkortasun hobea dela baieztatuz.Horrela, Ore-ko trifenilaminaren fenilo-taldeak paper garrantzitsua betetzen du molekula arteko karga-transferentzia eta banda-egitura elektronikoa sortzeko.
Tumore metaketa eta in vivo biobateragarritasuna areagotzeko, RuDA gehiago kapsulatu dugu F127rekin.RuDA-NPs-en batez besteko diametro hidrodinamikoa 123,1 nm-koa dela zehaztu zen, banaketa estu batekin (PDI = 0.089) argiaren dispertsio dinamikoa (DLS) metodoa erabiliz (5A irudia), tumoreen metaketa sustatu zuen iragazkortasuna eta atxikipena areagotuz.EPR) eragina.TEM irudiek erakutsi zuten Ore NP-ek forma esferiko uniformea ​​dutela, batez beste 86 nm-ko diametroarekin.Nabarmentzekoa, RuDA-NP-en xurgapen maximoa 800 nm-an agertu zen (24. irudi osagarria), RuDA-NP-ek RuDA auto-muntatzaileen funtzioak eta propietateak gorde ditzaketela adieraziz.NP Ore-ren ROS errendimendu kuantikoa kalkulatua % 15,9koa da, eta hori Ore-ren parekoa da.RuDA NP-en propietate fototermikoak 808 nm-ko uhin-luzera duen laser erradiazioen eraginpean aztertu ziren kamera infragorri baten bidez.irudian ikusten den bezala.5B,C, kontrol-taldeak (PBS soilik) tenperaturaren igoera apur bat izan zuen, RuDA-NPs soluzioaren tenperatura azkar handitu zen tenperatura handituz (ΔT) 15.5, 26.1 eta 43.0 °C-ra.Kontzentrazio handiak 25, 50 eta 100 µM izan ziren, hurrenez hurren, eta horrek RuDA NPren efektu fototermiko handia adierazten du.Horrez gain, beroketa/hozte zikloaren neurketak egin ziren RuDA-NP-ren egonkortasun fototermikoa ebaluatzeko eta ICGrekin alderatzeko.Ore NP-en tenperatura ez zen jaitsi bost berotze/hozte zikloren ondoren (5D. irudia), eta horrek adierazten du Ore NP-en egonkortasun fototermiko bikaina.Aitzitik, ICG-k egonkortasun fototermiko baxuagoa erakusten du tenperatura fototermikoko ordokiaren itxurazko desagerpenetik ikusita baldintza berdinetan.Aurreko metodoaren arabera58, RuDA-NP-ren bihurketa fototermikoaren eraginkortasuna (PCE) %24,2koa dela kalkulatu zen, hau da, lehendik dauden material fototermikoak baino handiagoa, hala nola urre-nano-estalkiak (%21,0) eta urre-nano-oskolak (%13,0)59.Horrela, NP Ore-k propietate fototermiko bikainak erakusten ditu, eta horrek PTT agente itxaropentsu bihurtzen ditu.
RuDA NPen DLS eta TEM irudien analisia (txertatzea).B 808 nm-ko (0,5 W cm-2) uhin-luzeran laser erradiazioa jasan duten RuDA NP-en hainbat kontzentrazioen irudi termikoak.C Mea NPren hainbat kontzentrazioen bihurtze fototermiko kurbak, datu kuantitatiboak direnak.B. D ORE NP eta ICGren tenperatura igoera 5 berotze-hozte ziklotan.
RuDA NPren fotozitotoxikotasuna MDA-MB-231 giza bularreko minbizi-zelulen aurka ebaluatu zen in vitro.irudian ikusten den bezala.6A, B, RuDA-NPs eta RuDAk zitotoxikotasun arbuiagarria erakutsi zuten irradiaziorik ezean, RuDA-NPs eta RuDA-ren toxikotasun ilun txikiagoa suposatuz.Hala ere, 808 nm-ko uhin-luzerarako laser erradiazioan esposizioaren ondoren, RuDA eta RuDA NP-ek fotozitotoxikotasun handia erakutsi zuten MDA-MB-231 minbizi-zelulen aurka IC50 balioekin (erdi-gehieneko kontzentrazio inhibitzailearekin) 5,4 eta 9,4 μM, hurrenez hurren, frogatuz. RuDA-NP eta RuDA minbiziaren fototerapiarako potentziala dutela.Horrez gain, RuDA-NP eta RuDAren fotozitotoxikotasuna C bitaminaren (Vc) presentzian ikertu zen, ROSen eroslea, argiak eragindako zitotoxikotasunean ROSek duen eginkizuna argitzeko.Jakina, zelulen bideragarritasuna handitu egin zen Vc gehitu ondoren, eta RuDA eta RuDA NPren IC50 balioak 25,7 eta 40,0 μM izan ziren, hurrenez hurren, eta horrek frogatzen du ROSek RuDA eta RuDA NPen fotozitotoxikotasunean duen eginkizun garrantzitsua.MDA-MB-231 minbizi-zeluletan RuDA-NPs eta RuDA argiak eragindako zitotoxikotasuna zelula bizi/hildako tindaketaren bidez AM kaltzeina (fluoreszentzia berdea zelula bizientzat) eta propidio ioduroa (PI, zelula hilentzako fluoreszentzia gorria) erabiliz.zelulek baieztatu) zunda fluoreszente gisa.6C irudian ikusten den bezala, RuDA-NP edo RuDArekin tratatutako zelulak irradiaziorik gabe bideragarriak izaten jarraitzen zuten, fluoreszentzia berde biziak frogatzen duen moduan.Aitzitik, laser irradiaziopean, fluoreszentzia gorria baino ez zen ikusi, RuDA edo RuDA NPen fotozitotoxikotasun eraginkorra baieztatzen duena.Aipagarria da Vc gehitzean fluoreszentzia berdea agertu zela, RuDA eta RuDA NPen fotozitotoxikotasunaren urraketa adierazten duena.Emaitza hauek bat datoz in vitro fotozitotoxikotasun saiakuntzekin.
A RuDA- eta B RuDA-NP zelulen dosiaren araberako bideragarritasuna MDA-MB-231 zeluletan Vc (0,5 mM) presentzian edo ezean, hurrenez hurren.Errore-barrak, batez bestekoa ± desbideratze estandarra (n = 3). Parekatu gabeko, bi aldeetako t probak *p < 0,05, **p < 0,01 eta ***p < 0,001. Parekatu gabeko, bi aldeetako t probak *p < 0,05, **p < 0,01 eta ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 eta ***p <0,001. Bi isatseko t-proba paregabeak *p<0,05, **p<0,01 eta ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 eta ***p <0,001. Bi isatseko t-proba paregabeak *p<0,05, **p<0,01 eta ***p<0,001.C Zelula bizi/hildako tindaketa analisia AM kaltzeina eta propidio ioduroa zunda fluoreszente gisa erabiliz.Eskala-barra: 30 µm.Talde bakoitzeko hiru errepikapen biologikoren irudi adierazgarriak erakusten dira.D MDA-MB-231 zeluletan ROS ekoizpenaren fluoreszentzia konfokaleko irudiak tratamendu-baldintza desberdinetan.DCF fluoreszentzia berdeak ROSen presentzia adierazten du.Irradiatu 0,5 W/cm2-ko potentzia duen 808 nm-ko uhin-luzera duen laser batekin 10 minutuz (300 J/cm2).Eskala-barra: 30 µm.Talde bakoitzeko hiru errepikapen biologikoren irudi adierazgarriak erakusten dira.E Fluxu-zitometria RuDA-NPs (50 µM) edo RuDA (50 µM) tratamenduaren analisia 808 nm-ko laserrekin edo gabe (0,5 W cm-2) Vc (0,5 mM) presentzian eta ezean 10 min.Talde bakoitzeko hiru errepikapen biologikoren irudi adierazgarriak erakusten dira.F Nrf-2, HSP70 eta HO-1 MDA-MB-231 zelulen RuDA-NPs (50 µM) 808 nm-ko laser irradiazioarekin edo gabe tratatu (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), zelulek adierazten dute 2).Talde bakoitzeko bi errepikapen biologikoren irudi adierazgarriak erakusten dira.
Zelula barneko ROS ekoizpena MDA-MB-231 zeluletan 2,7-diklorodihidrofluoreszeina diazetatoa (DCFH-DA) tindaketa metodoa erabiliz aztertu zen.irudian ikusten den bezala.6D, RuDA-NPs edo RuDA-rekin tratatutako zelulek fluoreszentzia berde desberdina erakusten zuten 808 nm-ko laserrarekin irradiatuta, RuDA-NPs eta RuDAk ROS sortzeko gaitasun eraginkorra dutela adieraziz.Aitzitik, argirik ezean edo Vc-ren presentzian, zelulen seinale fluoreszente ahul bat baino ez zen ikusi, eta horrek ROSen eraketa apur bat adierazten zuen.RuDA-NP zeluletan eta RuDA-rekin tratatutako MDA-MB-231 zeluletan ROS barneko mailak gehiago zehaztu ziren fluxu zitometriaren bidez.25. Irudi osagarrian erakusten den bezala, RuDA-NPs eta RuDAk 808 nm-ko laser irradiaziopean sortutako batez besteko fluoreszentzia intentsitatea (MFI) nabarmen handitu zen 5,1 eta 4,8 aldiz, hurrenez hurren, kontrol taldearekin alderatuta, AFK eraketa bikaina baieztatuz.edukiera.Hala ere, RuDA-rekin tratatutako RuDA-NP edo MDA-MB-231 zeluletan ROS barneko mailak laser irradiaziorik gabeko kontrolekin edo Vc-ren presentzian soilik konpara daitezke, fluoreszentzia konfokalaren analisiaren emaitzen antzera.
Frogatuta dago mitokondriak Ru(II)-areno konplexuen helburu nagusia direla60.Hori dela eta, RuDA eta RuDA-NP-en lokalizazio azpizelularra ikertu zen.26. Irudi osagarrian erakusten den bezala, RuDAk eta RuDA-NPk antzeko banaketa-profilak erakusten dituzte, mitokondrioetan metaketa handiena dutenak (62,5 ± 4,3 eta 60,4 ± 3,6 ng/mg proteina, hurrenez hurren).Hala ere, Ore eta NP Ore-ren frakzio nuklearretan Ru kopuru txiki bat baino ez zen aurkitu (% 3,5 eta 2,1, hurrenez hurren).Gainerako zelulen frakzioak hondar rutenioa zuen: % 31,7 (30,6 ± 3,4 ng/mg proteina) RuDArentzat eta % 42,9 (47,2 ± 4,5 ng/mg proteina) RuDA-NPentzat.Oro har, Ore eta NP Ore mitokondrioetan pilatzen dira batez ere.Mitokondrialaren disfuntzioa ebaluatzeko, JC-1 eta MitoSOX Red tindaketa erabili ditugu, mitokondrialaren mintz potentziala eta superoxidoa ekoizteko ahalmena ebaluatzeko, hurrenez hurren.27. irudi osagarrian erakusten den moduan, berde bizia (JC-1) eta gorria (MitoSOX Red) fluoreszentzia ikusi zen RuDA eta RuDA-NPekin 808 nm-ko laser irradiaziopean tratatutako zeluletan, RuDA eta RuDA-NP-ak oso fluoreszenteak direla adieraziz. Mintz mitokondrialaren despolarizazioa eta superoxidoaren ekoizpena eraginkortasunez eragin ditzake.Gainera, zelulen heriotzaren mekanismoa V-FITC/propidio ioduroaren (PI) fluxu-zitometrian oinarritutako analisiaren bidez zehaztu zen.6E irudian erakusten den moduan, 808 nm-ko laserrekin irradiatuta, RuDA eta RuDA-NP-k apoptosi tasa goiztiarra (eskuineko beheko koadrantea) nabarmen handitu zuten MDA-MB-231 zeluletan PBS edo PBS gehi laserarekin alderatuta.prozesatutako zelulak.Hala ere, Vc gehitu zenean, RuDA eta RuDA-NPren apoptosi-tasa nabarmen jaitsi zen %50,9tik %52,0tik %15,8ra eta %17,8ra, hurrenez hurren, eta horrek baieztatzen du ROSek RuDA eta RuDA-NPren fotozitotoxikotasunean duen eginkizun garrantzitsua..Horrez gain, zelula nekrotiko arinak ikusi ziren probatutako talde guztietan (goiko ezkerreko koadrantea), RuDA eta RuDA-NP-ek eragindako zelulen heriotzaren forma nagusi apoptosia izan daitekeela iradokiz.
Estres oxidatiboaren kaltea apoptosiaren determinatzaile nagusia denez, 2 eritroidearekin lotutako faktore nuklearra, 2 faktorea (Nrf2) 62, sistema antioxidatzailearen funtsezko erregulatzailea, RuDA-NPs-ekin tratatutako MDA-MB-231-n ikertu zen.Irradiazioak eragindako RuDA NPen ekintza-mekanismoa.Aldi berean, beherako proteina heme oxigenasa 1 (HO-1) adierazpena ere detektatu zen.6F irudian eta 29. irudi osagarrian erakusten den moduan, RuDA-NP-k bidezko fototerapiak Nrf2 eta HO-1 adierazpen-mailak areagotu zituen PBS taldearekin alderatuta, RuDA-NP-ek estres oxidatiboaren seinaleztapen bideak estimula ditzakeela adieraziz.Horrez gain, RuDA-NPs63-ren efektu fototermikoa aztertzeko, Hsp70 bero-shock proteinaren adierazpena ere ebaluatu zen.Argi dago RuDA-NPs + 808 nm-ko laser irradiazioarekin tratatutako zelulek Hsp70-ren adierazpen handiagoa erakutsi zutela beste bi taldeekin alderatuta, hipertermiaren erantzun zelularra islatuz.
In vitro emaitza nabarmenek RuDA-NPren errendimendua in vivo ikertzera bultzatu gintuzten MDA-MB-231 tumoreekin sagu biluzietan.RuDA NPen ehunen banaketa gibelean, bihotzean, splean, giltzurrunetan, biriketan eta tumoreetan dagoen rutenioaren edukia zehaztuz aztertu zen.irudian ikusten den bezala.7A, organo normaletan Ore NP-en gehienezko edukia lehenengo behaketa-denboran agertu zen (4 h), eta gehienezko edukia tumore-ehunetan zehaztu zen injekzio ondoren 8 ordura, ziurrenik Ore NP-en ondorioz.LFren EPR eragina.Banaketa emaitzen arabera, NP mineralarekin tratamenduaren iraupen optimoa administratu eta 8 ordura hartu zen.RuDA-NP-ak tumore-guneetan pilatzeko prozesua ilustratzeko, RuDA-NP-en propietate fotoakustikoak (PA) kontrolatu ziren RuDA-NP-en PA seinaleak injekzio ondoren une desberdinetan erregistratuz.Lehenik eta behin, RuDA-NP-ren PA seinalea in vivo ebaluatu zen tumore gune baten PA irudiak grabatuz RuDA-NP-ren injekzio barne-tumoralaren ondoren.30. Irudi osagarrian erakusten den bezala, RuDA-NP-ek PA seinale indartsua erakutsi zuen, eta RuDA-NP kontzentrazioa eta PA seinalearen intentsitatearen arteko korrelazio positiboa zegoen (30A irudi osagarria).Ondoren, tumore-guneen PA in vivo irudiak RuDA eta RuDA-NP-ren zain barneko injekzioaren ondoren grabatu ziren injekzio ondorengo une desberdinetan.7B irudian erakusten den bezala, tumore-guneko RuDA-NP-en PA seinalea pixkanaka-pixkanaka handitu zen denborarekin eta lautadara iritsi zen injekzio ondorengo 8 orduetan, ICP-MS analisiak zehaztutako ehun-banaketa emaitzekin bat etorriz.RuDAri dagokionez (30B irudi osagarria), PA seinalearen intentsitate maximoa injektatu eta 4 ordura agertu zen, RuDA tumorean sartzeko abiadura azkarra dela adieraziz.Horrez gain, RuDA eta RuDA-NP-en iraitz-portaera ikertu zen gernuan eta gorotzetan rutenio kantitatea zehaztuz ICP-MS erabiliz.RuDA (31. irudi osagarria) eta RuDA-NP (7C irudia) ezabatzeko bide nagusia gorotz bidezkoa da, eta RuDA eta RuDA-NPen garbiketa eraginkorra ikusi zen 8 eguneko azterketa-aldian, hau da, RuDA eta RuDA-NPak eraginkortasunez ezaba daitezke gorputzetik epe luzerako toxikotasunik gabe.
A. RuDA-NP-ren ex vivo banaketa sagu-ehunetan Ru edukiaren arabera (ehun gramo bakoitzeko RuDA-ren (ID) administratutako dosiaren ehunekoa) zehaztu zen injekzioaren ondoren hainbat momentutan.Datuak batez bestekoa ± desbideratze estandarra dira (n = 3). Parekatu gabeko, bi aldeetako t probak *p < 0,05, **p < 0,01 eta ***p < 0,001. Parekatu gabeko, bi aldeetako t probak *p < 0,05, **p < 0,01 eta ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 eta ***p <0,001. Bi isatseko t-proba paregabeak *p<0,05, **p<0,01 eta ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 eta ***p <0,001. Bi isatseko t-proba paregabeak *p<0,05, **p<0,01 eta ***p<0,001.B PA irudiak in vivo tumore-guneen 808 nm-ko kitzikapenean, RuDA-NPak (10 µmol kg-1) zain barnean hartu ondoren, denbora-puntu ezberdinetan.RuDA NPs (10 µmol kg-1) zain barrutik administratu ondoren, saguetatik C Ru kanporatu zen gernuarekin eta gorotzekin denbora tarte ezberdinetan.Datuak batez bestekoa ± desbideratze estandarra dira (n = 3).
RuDA-NP in vivo-ren berotze-ahalmena MDA-MB-231 eta RuDA tumoreekin sagu biluzietan aztertu zen, alderatzeko.irudian ikusten den bezala.8A eta 32. irudi osagarria, kontroleko (gatz) taldeak tenperatura aldaketa gutxiago erakutsi zuen (ΔT ≈ 3 °C) 10 minutuz etengabeko esposizioaren ondoren.Hala ere, RuDA-NPs eta RuDAren tenperatura azkar igo zen 55,2 eta 49,9 °C-ko tenperatura maximoekin, hurrenez hurren, hipertermia nahikoa emanez in vivo minbiziaren terapiarako.RuDA NP-en (ΔT ≈ 24 °C) tenperatura altuaren igoera RuDArekin alderatuta (ΔT ≈ 19 °C) iragazkortasun hobea eta tumore-ehunetan metatzea EPR efektuaren ondorioz izan daiteke.
MDA-MB-231 tumoreak dituzten saguen irudi termiko infragorriak 808 nm-ko laser bidez irradiatuta, injekziotik 8 ordura une ezberdinetan.Talde bakoitzeko lau errepikapen biologikoren irudi adierazgarriak erakusten dira.B Tumorearen bolumen erlatiboa eta C tratamenduan zehar sagu talde ezberdinen tumore-masa batez bestekoa.D Sagu talde ezberdinen gorputz-pisuen kurbak.Irradiatu 0,5 W/cm2-ko potentzia duen 808 nm-ko uhin-luzera duen laser batekin 10 minutuz (300 J/cm2).Errore-barrak, batez bestekoa ± desbideratze estandarra (n = 3). Parekatu gabeko, bi aldeetako t probak *p < 0,05, **p < 0,01 eta ***p < 0,001. Parekatu gabeko, bi aldeetako t probak *p < 0,05, **p < 0,01 eta ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 eta ***p <0,001. Bi isatseko t-proba paregabeak *p<0,05, **p<0,01 eta ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 eta ***p <0,001. Bi isatseko t-proba paregabeak *p<0,05, **p<0,01 eta ***p<0,001. Tratamendu-talde desberdinetako organo eta tumore nagusien E H&E tindaketa-irudiak, besteak beste, gatza, gatz + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs eta RuDA-NPs + Laser taldeak. Tratamendu-talde desberdinetako organo eta tumore nagusien E H&E tindaketa-irudiak, besteak beste, gatza, gatz + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs eta RuDA-NPs + Laser taldeak. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. E H&E tratamendu-talde ezberdinetako organo eta tumore nagusien tindaketa-irudiak, gatz, gatz + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs eta RuDA-NPs + Laser taldeak barne.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，倁盐水+ 态盐水+ 来自不图像〉Ru-DA来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Tratamendu-talde ezberdinetako organo eta tumore nagusien E H&E tindaketa, besteak beste, gatz, gatz + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NPs eta RuDA-NPs + laserra.Eskala barra: 60 µm.
Fototerapiaren in vivo RuDA eta RuDA NPs-ekin MDA-MB-231 tumoreak dituzten sagu biluziek RuDA edo RuDA NP-ekin zain barnean injektatu zituzten 10,0 µmol kg-1 dosi bakarrean buztanaren bidez, eta gero 8. injekzio ondoren orduak.laser irradiazioa 808 nm-ko uhin-luzera duena.8B irudian erakusten den bezala, tumoreen bolumenak nabarmen handitu ziren gatz eta laser taldeetan, eta horrek adierazten du gatz edo laser 808 irradiazioak eragin txikia izan zuela tumorearen hazkundean.Gatz taldean bezala, laser-irradiaziorik ezean RuDA-NP-ekin edo RuDArekin tratatutako saguetan ere tumore-hazkunde azkarra ikusi zen, haien toxikotasun ilun txikia erakutsiz.Aitzitik, laser irradiazioaren ondoren, RuDA-NP eta RuDA tratamenduek tumorearen atzerabide garrantzitsua eragin zuten, tumoreen bolumenaren %95,2 eta %84,3ko murrizketarekin, hurrenez hurren, gatz tratatutako taldearekin alderatuta, PDT sinergiko bikaina adieraziz., RuDA/CHTV efektuaren bitartez.– NP edo Ore. RuDArekin alderatuta, RuDA NP-ek efektu fototerapeutiko hobea erakutsi zuten, batez ere RuDA NP-en EPR efektuari zor zaiona.Tumorearen hazkundearen inhibizioaren emaitzak tratamenduaren 15. egunean kendutako tumorearen pisuaren arabera ebaluatu ziren (8C irudia eta 33 irudi osagarria).RuDA-NP tratatutako saguen eta RuDA tratatutako saguen batez besteko tumore-masa 0,08 eta 0,27 g-koa izan zen, hurrenez hurren, kontrol taldean baino askoz arinagoa (1,43 g).
Horrez gain, saguen gorputz-pisua hiru egunetik behin erregistratu zen RuDA-NP edo RuDA in vivo-ren toxikotasun iluna aztertzeko.8D irudian ikusten den bezala, ez zen desberdintasun esanguratsurik ikusi gorputz-pisuan tratamendu-talde guztietan. Gainera, tratamendu talde ezberdinetako organo nagusien (bihotza, gibela, spleen, birikak eta giltzurrunak) hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketa egin zen. Gainera, tratamendu talde ezberdinetako organo nagusien (bihotza, gibela, spleen, birikak eta giltzurrunak) hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketa egin zen. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Horrez gain, tratamendu talde ezberdinetako organo nagusien (bihotza, gibela, spleen, birikak eta giltzurrunak) hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketa egin zen.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进要器官（心脏、肝脏, (H&E) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Horrez gain, organo nagusien (bihotza, gibela, spleen, birikak eta giltzurrunak) hematoxilina eta eosina (H&E) tindaketa egin zen tratamendu talde ezberdinetan.Irudian ikusten den bezala.8E, RuDA-NPs eta RuDA taldeetako bost organo nagusien H&E tindaketa-irudiek ez dute ageriko anomaliarik edo organoen kalterik erakusten. 8E, RuDA-NPs eta RuDA taldeetako bost organo nagusien H&E tindaketa-irudiek ez dute ageriko anomaliarik edo organoen kalterik erakusten.irudian ikusten den bezala.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируют огонстрируют при постель. 8E, RuDA-NPs eta RuDA taldeetako bost organo nagusien H&E tindaketa-irudiek ez dute ageriko organo anomaliarik edo lesiorik erakusten.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出显示出显示傘显示出显示出如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8e, изображения окрашивания окрашивания ос пя из орупп из орупп из орупп не показали явных аномалий или повреждения органов. 8E irudian ikusten den bezala, RuDA-NPs eta RuDA taldeetako bost organo nagusien H&E tindaketa-irudiek ez zuten ageriko anomaliarik edo organo-kalterik erakutsi.Emaitza hauek erakutsi zuten ez RuDA-NPk ez RuDAk ez zutela toxikotasun zantzurik erakusten in vivo. Gainera, tumoreen H&E tindaketa-irudiek RuDA + Laser eta RuDA-NPs + Laser taldeek minbizi-zelulen suntsipen larria eragin dezaketela erakutsi zuten, RuDA eta RuDA-NP-en in vivo eraginkortasun fototerapeutiko bikaina erakutsiz. Gainera, tumoreen H&E tindaketa-irudiek RuDA + Laser eta RuDA-NPs + Laser taldeek minbizi-zelulen suntsipen larria eragin dezaketela erakutsi zuten, RuDA eta RuDA-NP-en in vivo eraginkortasun fototerapeutiko bikaina erakutsiz.Gainera, hematoxilina-eosina zikindutako tumoreen irudiek RuDA+Laser eta RuDA-NPs+Laser taldeek minbizi-zelulen suntsipen larria eragin dezaketela erakutsi zuten, RuDA eta RuDA-NP-en eraginkortasun fototerapeutikoa in vivo frogatuz.此外, 肿瘤 的 H & E 染色 图像 显示, Ruda + Laser 和 Ruda-NPS + Laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 破坏, 证明 了 Ruda 和 Ruda-NPS 的 优异 优异 的 体内 功效.此外, 肿瘤 的 & E 染色 显示, Ruda + Laser 和 Ruda-NPS + Laser 组均 导致 的 癌 细胞 破坏, 证明 了 Ruda-NPs 的 的 的 体内 光疗 ............. 。。。Gainera, hematoxilina eta eosina zikindutako tumoreen irudiek RuDA+Laser eta RuDA-NPs+Laser taldeek minbizi-zelulen suntsipen larria eragin zutela erakutsi zuten, RuDA eta RuDA-NP-en eraginkortasun fototerapeutikoa in vivo frogatuz.
Ondorioz, DA motako ligandoekin Ru(II)-areno (RuDA) konplexu organometalikoa ISC prozesua errazteko diseinatu zen agregazio metodoa erabiliz.Sintetizatutako RuDA interakzio ez-kobalenteen bidez auto-muntatu daiteke RuDAtik eratorritako sistema supramolekularrak eratzeko, horrela 1O2 eraketa eta argiak eragindako minbiziaren terapiarako konbertsio fototermiko eraginkorra erraztuz.Azpimarratzekoa da RuDA monomerikoak ez zuela 1O2-rik sortu laser-irradiaziopean 808 nm-tan, baina 1O2-kopuru handia sor zezakeela egoera agregatuan, gure diseinuaren arrazionaltasuna eta eraginkortasuna erakutsiz.Ondorengo ikerketek erakutsi dutenez, muntaketa supramolekularrak RuDAri propietate fotofisiko eta fotokimiko hobeak ematen dizkiola, hala nola, gorri-lehiaketa-xurgapena eta foto-zuritzeko erresistentzia, PDT eta PTT prozesatzeko oso desiragarriak direnak.In vitro zein in vivo esperimentuek erakutsi dute biobateragarritasun ona eta tumorean metaketa ona duten RuDA NPek argiak eragindako minbiziaren aurkako jarduera bikaina erakusten dutela laser irradiazioan 808 nm-ko uhin-luzeran.Horrela, RuDA NP-ek PDT/PTW erreaktibo supramolekular bimodal eraginkor gisa aberastuko dute 800 nm-tik gorako uhin-luzeretan aktibatutako fotosensibilizatzaileen multzoa.Sistema supramolekularraren diseinu kontzeptualak NIR bidez aktibatutako fotosensibilizatzaileentzako bide eraginkorra eskaintzen du efektu fotosensibilizatzaile bikainak dituztenentzat.
Produktu kimiko eta disolbatzaile guztiak hornitzaile komertzialengandik lortu ziren eta beste arazketarik gabe erabili ziren.RuCl3 Boren Precious Metals Co., Ltd.-ri erosi zitzaion (Kunming, Txina).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-phenanthroline-5,6-diona) eta 4,7-bis[4-(N,N-diphenylamino)phenyl]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazola aurreko ikerketen arabera sintetizatu zen64,65.NMR espektroak Bruker Avance III-HD 600 MHz espektrometroan grabatu ziren Southeastern University Analytical Test Center-en d6-DMSO edo CDCl3 disolbatzaile gisa erabiliz.Desplazamendu kimikoak δ ppm-tan ematen dira.tetrametilsilanoari dagokionez, eta J interakzio-konstanteak balio absolutuetan ematen dira hertzetan.Bereizmen handiko masa-espektrometria (HRMS) Agilent 6224 ESI/TOF MS tresna batean egin zen.C, H eta N-ren analisi elementala Vario MICROCHNOS analizatzaile elemental batean (Elementar) egin zen.UV-ikusten diren espektroak Shimadzu UV3600 espektrofotometroan neurtu dira.Fluoreszentzia-espektroak Shimadzu RF-6000 espektrofluorimetroan erregistratu ziren.EPR espektroak Bruker EMXmicro-6/1 tresna batean grabatu ziren.Prestatutako laginen morfologia eta egitura 200 kV-ko tentsioan funtzionatzen duten FEI Tecnai G20 (TEM) eta Bruker Icon (AFM) tresnetan aztertu dira.Argiaren sakabanaketa dinamikoa (DLS) Nanobrook Omni analizatzaile batean (Brookhaven) egin zen.Propietate fotoelektrokimikoak konfigurazio elektrokimiko batean neurtu ziren (CHI-660, Txina).Irudi fotoakustikoak FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR sistema erabiliz lortu dira.Irudi konfokalak Olympus FV3000 mikroskopio konfokala erabiliz lortu dira.FACS analisia BD Calibur fluxu-zitometroan egin zen.Errendimendu handiko kromatografia likidoaren (HPLC) esperimentuak Waters Alliance e2695 sisteman egin ziren 2489 UV/Vis detektagailu bat erabiliz.Gel Permeation Chromatography (GPC) probak Thermo ULTIMATE 3000 tresna batean grabatu ziren ERC RefratoMax520 errefrakzio-indize detektagailu bat erabiliz.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-phenanthroline-5,6-dione)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-diphenylamino)phenyl]-5,6-diamino-2,1,3-benzothiadiazole 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) eta azido azetiko glaziala (30 ml) errefluxu hozkailuan irabiatu ziren 12 orduz.Ondoren, disolbatzailea hutsean kendu zen lurrungailu birakari batekin.Sortutako hondarra flash zutabe kromatografia bidez purifikatu zen (silize gel, CH2Cl2:MeOH=20:1) RuDA hauts berde gisa lortzeko (errendimendua: 877,5 mg, % 80).uzkia.C64H48Cl2N8RuS-rako kalkulatua: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Aurkitu: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H RMN (600 MHz, d6-DMSO) δ 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C NMR (150 MHz, D6-DMSO), δ (PPM) 158,03, 152.81, 149.31, 147.98, 147,16, 139,98, 136,98, 135.68, 130.68, 128.68, 128.68, 128.68, 128.68, 103.49, 103.49 , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazolaren (L2) sintesia: L2 bi urratsetan sintetizatu zen.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) N,N-dietil-4-(tributylstannyl)anilina (1,05 g, 2,4 mmol) eta 4,7-dibromo-5,6-dinitro disoluzioari gehitu zitzaion - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) tolueno lehorrean (100 ml).Nahasketa 100 °C-tan irabiatu zen 24 orduz.Toluenoa hutsean kendu ondoren, sortutako solidoa petrolio-eterrez garbitu zen.Ondoren, konposatu honen (234,0 mg, 0,45 mmol) eta burdin-hautsa (0,30 g, 5,4 mmol) azido azetikoan (20 ml) nahasketa bat irabiatu zen 80° C-tan 4 orduz.Erreakzio-nahasketa uretara isurtzen zen eta ondoriozko solido marroia filtrazio bidez bildu zen.Produktua bi aldiz araztu zen hutsean sublimazioz solido berde bat emateko (126,2 mg, % 57ko etekina).uzkia.C26H32N6S-rako kalkulatua: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Aurkitu: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H RMN (600 MHz, CDCl3), δ (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13С NMR (150 MHz, CDCl3), δ (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Konposatuak RuDAren antzeko prozedurak jarraituz prestatu eta araztu ziren.uzkia.C48H48Cl2N8RuS-rako kalkulatua: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Aurkitu: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H RMN (600 MHz, d6-DMSO), δ (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13C NMR (151 MHz, CDCL3), δ (PPM) 158,20, 153,36, 153,36, 148,14, 138,14, 138,59, 136,79, 135,99, 136,71, 131.35, 121.76, 105,07, 104.23, 87,0, 84.4., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA MeOH/H2On (5/95, v/v) disolbatu zen 10 μM-ko kontzentrazioan.RuDA-ren xurgapen-espektroa 5 minuturo neurtu zen Shimadzu UV-3600 espektrofotometroan 808 nm-ko (0,5 W/cm2) uhin-luzera duen laser-argiarekin irradiaziopean.ICG espektroak estandarraren baldintza berdinetan grabatu ziren.
EPR espektroak Bruker EMXmicro-6/1 espektrometro batean grabatu ziren 20 mW-ko mikrouhin-potentziarekin, 100 G-ko eskaneaketa-tartearekin eta 1 G-ko eremu-modulazioarekin. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidona. (TEMP) eta 5,5-dimetil-1-pirrolina N-oxidoa (DMPO) spin tranpa gisa erabili ziren.Elektronien spin-erresonantzia-espektroak RuDA (50 µM) eta TEMF (20 mM) edo DMPO (20 mM) disoluzio mistoetarako grabatu ziren 808 nm (0,5 W/cm2) uhin-luzera duen laser erradiazioen eraginez.
RuDArako DFT eta TD-DFT kalkuluak PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ mailetan egin ziren ur-disoluzio batean 1666,67,68 Gauss programa erabiliz.RuDA energia baxuko singlete egoera kitzikatuaren HOMO-LUMO, zulo eta elektroien banaketak GaussView programaren bidez (5.0 bertsioa) marraztu ziren.
Lehenik eta behin, 1O2 RuDAren sorrera-eraginkortasuna neurtzen saiatu ginen UV-ikuspegiko ohiko espektroskopia erabiliz ICG (ΦΔ = 0.002) estandar gisa, baina ICGaren fotodegradazioak eragin handia izan zuen emaitzetan.Horrela, 1O2 RuDAren etekin kuantikoa 808 nm (0,5 W/cm2) uhin-luzera duen laser batekin irradiatzean 428 nm inguruko ABDA fluoreszentziaren intentsitatearen aldaketa detektatuz neurtu zen.Esperimentuak RuDA eta RuDA NP-ekin (20 μM) egin ziren ABDA (50 μM) duten ur/DMF (98/2, v/v) batean.1O2-ren etekin kuantikoa honako formula hau erabiliz kalkulatu da: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS eta rICG ABDAren erreakzio-abiadurak dira fotosensibilizatzailetik eta ICGtik lortutako 1O2rekin, hurrenez hurren.APS eta AICG fotosensibilizatzailearen eta ICG 808 nm-ko xurgapena dira, hurrenez hurren.
AFM neurketak likido-baldintzetan egin ziren Bruker Dimension Icon AFM sistemako eskaneatu modua erabiliz.Zelula likidoak dituen egitura irekia erabiliz, zelulak bi aldiz garbitu eta etanolarekin eta lehortu nitrogeno korronte batekin.Sartu zelula lehorrak mikroskopioaren buru optikoan.Berehala jarri laginaren tanta bat likido-igerilekuan eta jarri kantileveran botatzeko plastikozko xiringa esterila eta orratz esterila erabiliz.Beste tanta bat laginaren gainean jartzen da zuzenean, eta buru optikoa jaisten denean, bi tantak bat egiten dute, laginaren eta likido-biltegiaren artean menisko bat osatuz.AFM neurketak SCANASYST-FLUID V-formako nitruro-kantilever baten bidez egin dira (Bruker, gogortasuna k = 0,7 N m-1, f0 = 120-180 kHz).
HPLC kromatogramak phoenix C18 zutabe batez hornitutako Waters e2695 sistema batean lortu ziren (250×4,6 mm, 5 µm) 2489 UV/Vis detektagailu bat erabiliz.Detektagailuaren uhin-luzera 650 nm-koa da.A eta B fase mugikorrak ura eta metanola ziren, hurrenez hurren, eta fase mugikorraren emaria 1,0 ml·min-1 izan zen.Gradientea (B disolbatzailea) honakoa izan zen: % 100etik 4 minutura, % 100etik % 50era 5etik 30era eta % 100era berrezarri 31tik 40 minutura.Mea metanol eta ur (50/50, bolumenaren arabera) disoluzio misto batean disolbatu zen 50 μM-ko kontzentrazioan.Injekzio bolumena 20 μl zen.
GPC entseguak PL aquagel-OH MIXED-H zutabe bi (2 × 300 × 7,5 mm, 8 µm) eta ERC RefratoMax520 errefrakzio indize detektagailu batekin hornitutako Thermo ULTIMATE 3000 tresna batean grabatu ziren.GPC zutabea urarekin eluatu zen 1 ml/min-ko emaria 30 °C-tan.Ore NPak PBS disoluzioan disolbatu ziren (pH = 7,4, 50 μM), injekzio bolumena 20 μL zen.
Fotokorronteak konfigurazio elektrokimiko batean neurtu ziren (CHI-660B, Txina).Laserra piztu eta itzaltzean (808 nm, 0,5 W/cm2) erantzun optoelektronikoak 0,5 V-ko tentsioan neurtu dira kutxa beltz batean, hurrenez hurren.Hiru elektrodoko zelula estandar bat erabili zen L itxurako beirazko karbono-elektrodo batekin (GCE) lan-elektrodo gisa, kalomel-elektrodo estandar batekin (SCE) erreferentzia-elektrodo gisa eta platinozko disko batekin kontra-elektrodo gisa.0,1 M Na2SO4 disoluzio bat erabili da elektrolito gisa.
MDA-MB-231 giza bularreko minbiziaren zelula-lerroa KeyGEN Biotec Co., LTD-ri erosi zitzaion (Nanjing, Txina, katalogo zenbakia: KG033).Zelulak monogeruzatan hazi ziren Dulbecco-ren Modified Eagle's Medium (DMEM, glukosa altua) %10 fetal behi-serum (FBS), penizilina (100 μg/ml) eta estreptomizina (100 μg/ml) disoluzio batekin osatuta.Zelula guztiak 37 °C-tan hazi ziren atmosfera heze batean, %5 CO2 zuen.
MTT saiakera RuDA eta RuDA-NP-en zitotoxikotasuna zehazteko erabili zen argi irradiazioaren presentzian eta ezean, Vc (0,5 mM) edo gabe.MDA-MB-231 minbizi-zelulak 96 putzuko plaketan hazi ziren gutxi gorabehera 1 x 105 zelula/ml/putzu zelulen dentsitatean eta 12 orduz inkubatu ziren 37,0 °C-tan, %5 CO2 eta %95 aireko atmosferan.Uretan disolbatutako RuDA eta RuDA NP-ak gehitu zitzaizkien zelulei.12 orduko inkubazioaren ondoren, zelulak 0,5 W cm -2 laser erradiazioarekin jasan zituzten 808 nm-ko uhin-luzeran 10 minutuz (300 J cm -2) eta gero ilunpetan inkubatu ziren 24 orduz.Ondoren, zelulak MTT (5 mg/ml) beste 5 orduz inkubatu ziren.Azkenik, aldatu bitartekoa DMSOra (200 µl) sortzen diren formazan kristal moreak disolbatzeko.OD balioak 570/630 nm-ko uhin-luzera duen mikroplaken irakurgailu baten bidez neurtu ziren.Lagin bakoitzaren IC50 balioa SPSS softwarea erabiliz kalkulatu da gutxienez hiru esperimentu independentetan lortutako dosi-erantzun kurbetatik.
MDA-MB-231 zelulak RuDA eta RuDA-NPrekin tratatu ziren 50 μM-ko kontzentrazioan.12 orduko inkubazioaren ondoren, zelulak 808 nm-ko uhin-luzera eta 0,5 W/cm2-ko potentzia duen laser batekin irradiatu ziren 10 minutuz (300 J/cm2).C bitamina (Vc) taldean, zelulak 0,5 mM Vc-rekin tratatu ziren laser irradiazioaren aurretik.Gero, zelulak ilunpetan inkubatu ziren 24 ordu gehiagoz, ondoren kaltzeina AM eta propidio ioduroarekin (20 μg/ml, 5 μl) 30 minutuz tindatu ziren, ondoren PBSrekin (10 μl, pH 7,4) garbitu.zikindutako zelulen irudiak.