Berriak

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Ester aktibatuetan edo fenoxi erradikaletan oinarritutako hurbiltasun entzimatikoen etiketatze-metodoak oso erabiliak dira zelula bizidunetako proteomak eta proteina-interaktoreak mapatzeko.Hala ere, ester aktibatuak ez dira hain erreaktiboak, eta etiketatze-erradio zabala eragiten dute, eta peroxidoaren tratamenduak sortutako fenoxi erradikalek redox bideak oztopatu ditzakete.Hemen miniSOG fotosensibilizatzaile proteina interesgarri den proteina batekin genetikoki lotuz garatutako hurbiltasunaren etiketatze menpeko fotoaktibazio metodo baten berri ematen dugu (PDPL).Argi urdinak piztuta eta esposizio-denborak kontrolatuta, oxigeno singletea sortzen da eta, ondoren, anilina zundaren bidez histidina-hondakinen etiketatze espazio-temporalki ebatzita lortzen da.Bere fideltasun handia frogatzen dugu organulu espezifikoen proteomaren maparen bidez.PDPL-ren alboan TurboID-ekin alderatuz gero, PDPL-ren estaldura proteomiko zehatzagoa eta zabalagoa erakusten da.Ondoren, gaixotasunari lotutako transkripzio-koaktibatzaile BRD4 eta E3 Parkin ligaseari PDPL aplikatu diogu eta orain arte ezezagunak diren interaktoreak aurkitu ditugu.Gain-espresioaren baheketaren bidez, bi substratu ezezagun, Ssu72 eta SNW1, identifikatu ziren Parkinarentzat, zeinaren degradazioa ubikitinazio-proteasoma bidearen bitartez.
Proteina-sareen karakterizazio zehatza oinarrizko zelula-prozesu askoren azpian dago.Hori dela eta, proteina-interakzioen espazio-denborazko mapak oso zehatzak oinarri molekularrak emango ditu bide biologikoak, gaixotasunen patologia deszifratzeko eta elkarrekintza horiek helburu terapeutikoetarako eteteko.Horretarako, oso desiragarriak dira zelula edo ehun bizietan denborazko elkarrekintzak detektatzeko gai diren metodoak.Afinitate Purifikazio Masa Espektrometria (AP-MS) historikoki erabili izan da interesgarri diren proteinen (POI) lotura-partaideak identifikatzeko.Proteomika kuantitatiboen metodoen garapenarekin, Bioplex3.0 sortu zen, AP-MSn oinarritutako proteina sareen datu-base handiena.AP-MS oso indartsua den arren, lan-fluxuko zelulen lisi eta diluzio-urratsak lotura-interakzio ahul eta iragankorretan alboratuta daude eta lisiaren osteko artefaktuak sartzen dituzte, hala nola, lisiaren aurretik konpartimentaziorik ez duten interakzio-bikote faltsuak.
Arazo horiei aurre egiteko, gurutzaketa-taldeak eta gertuko etiketatze entzimatikoko (PL) plataformak dituzten aminoazido ez-naturalak (UAA) garatu dira (adibidez, APEX eta BioID)5.UAA metodoa agertoki askotan arrakastaz aplikatu eta proteina itsasgarri zuzenei buruzko informazioa ematen badu ere, oraindik ere beharrezkoa da UAA txertatzeko gunearen optimizazioa.Are garrantzitsuagoa dena, etiketatze-gertaeren iraulketa katalitikorik ez duen metodo estekiometriko bat da.Aitzitik, PL metodo entzimatikoek, hala nola BioID metodoak, ingeniaritza biotina ligasa POI7-rekin fusionatzen dute, eta, ondoren, biotina aktibatzen du biotinyl-AMP ester erreaktiboko tarteko bat osatzeko.Entzimak, beraz, lisina-hondakin proximalak etiketatzen dituen biotina aktibatuta "hodeia" katalizatzen eta askatzen du.Hala ere, BioID-ek 12 ordu baino gehiago behar ditu etiketatutako seinale nahikoa lortzeko, eta horrek denborazko bereizmenarekin erabiltzea galarazten du.Legamiaren pantailan oinarritutako eboluzio zuzendua erabiliz, TurboID BioIDn oinarrituta diseinatu zen eraginkorragoa izateko, biotinarekin 10 minutuko epean etiketatze eraginkorra ahalbidetuz, prozesu dinamikoagoak aztertzeko aukera emanez.TurboID oso aktiboa denez eta biotina-maila endogenoa maila baxuko etiketatze nahikoa denez, atzeko planoko etiketatzea arazo potentziala bihurtzen da biotina exogenoa gehitzean etiketatze oso hobetua eta denborazkoa behar denean.Gainera, ester aktibatuak oso erreaktiboak dira (t1/2 ~ 5 min), eta horrek etiketatze-erradio handia ekar dezake, batez ere aldameneko proteinak 5 biotinaz saturatu ondoren. Beste ikuspegi batean, askorbato peroxidasaren (hau da, biotina- fenol erradikalak eta proteinak etiketatzea ahalbidetzen du minutu batean9, 10. APEX oso erabilia da zelula azpiko proteomak, mintz-proteina-konplexuak eta zitosoliko seinaleztapen-proteina-konplexuak identifikatzeko11, 12. Hala ere, peroxidoen kontzentrazio handien beharrak redox proteinak edo bideak eten ditzake. prozesu zelularrak.
Hortaz, zehaztasun espazial eta tenporal handiko erradio-erreaktiboagoak sortzeko gai den metodo berri bat zelula-bideak nabarmen eten gabe lehendik dauden metodoen osagarri garrantzitsua izango da. Espezie erreaktiboen artean, oxigeno singleteak arreta piztu zigun bere bizitza laburra eta difusio-erradio mugatuagatik (t1/2 < 0,6 µs zeluletan)13. Espezie erreaktiboen artean, oxigeno singleteak arreta piztu zigun bere bizitza laburra eta difusio-erradio mugatuagatik (t1/2 < 0,6 µs zeluletan)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Forma aktiboen artean, oxigeno singleteak arreta erakarri zuen bere bizitza laburra eta difusio-erradio mugatuagatik (t1/2 < 0,6 µs zeluletan)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs中其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs（1 µs（ 1 µs（ 起 滆有限（细胞中t1/2 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Forma aktiboen artean, oxigeno singletak gure arreta erakartzen du bere bizitza laburra eta difusio-erradio mugatua duelako (t1/2 < 0,6 μs zeluletan).Oxigeno singletak metionina, tirosina, histidina eta triptofanoa ausaz oxidatzen dituela jakinarazi da, 14,15 polar bihurtuz amina edo tiol oinarritutako zundetara atxikitzeko16,17.Oxigeno singletea konpartimentu azpiko RNA etiketatzeko erabili bada ere, POI hurbiltasun-markatzaile endogenoak berriro erabiltzeko estrategiak ikertu gabe daude.Hona hemen, fotoaktibazio-menpeko hurbiltasunaren etiketatzea (PDPL) izeneko plataforma bat aurkezten dugu, non argi urdina erabiltzen dugun miniSOG fotosentsibilizatzaile batekin fusionatutako POI argitzeko eta oxigeno-sorkuntza abiarazten dugun hondar proximalak oxidatzeko, ondoren amina duten aldaketak zunda kimikoak oxidatzeko. tarteko zelula bizidunak..Zunda kimiko talde bat probatu genuen etiketaren espezifikotasuna maximizatzeko eta aldatzeko guneak identifikatu genituen proteomikako lan-fluxu ireki baten bidez.PDPL-ren alboan TurboID-ekin alderatuz gero, PDPL-ren estaldura proteomiko zehatzagoa eta zabalagoa erakusten da.Hurbilketa hau proteoma azpizelularren organulu espezifikoen markatzaileei eta proteomaren identifikazio orokorrari aplikatu genion minbiziari lotutako BRD4 proteina erregulatzaile epigenetikorako eta Parkinson gaixotasunari lotutako E3 ligasa Parkin, zeinak proteina sare ezaguna eta ezezaguna baieztatu zuen. elkarrekintzak..PDPLk proteina konplexu handietan E3 substratuak antzemateko duen gaitasunak zeharkako lokailuen aitorpena eskatzen duen egoera adierazten du.Ubikitinazio-proteasomaren bitartez bi parkin substratu ezezagun baieztatu dira in situ.
Terapia fotodinamikoa (PDT)19 eta kromoforoz lagundutako laser inaktibazioa (CALI)20, zeinetan fotosensibilizatzaileekin argiaren irradiazioak oxigeno singletea sortzen duen, xede-proteinak desaktibatu edo zelulen heriotza eragin dezakete.Oxigeno singletea 70 nm inguruko difusio-distantzia teorikoa duen substantzia oso erreaktiboa denez, fotosensibilizatzailearen inguruko oxidazio espazialki mugatua kontrolatu daiteke.Kontzeptu horretan oinarrituta, oxigeno singleta erabiltzea erabaki genuen zelula bizietan proteina-konplexuen etiketatze estua lortzeko.PDPL ikuspegi kimioproteomiko bat garatu dugu lau funtzio betetzeko: (1) PL entzimatikoaren antzeko oxigeno singlet aktiboaren sorrera katalizatzea;(2) argia hastean denboran ebatzitako etiketa ematea;(3) alterazioaren bidez (4) Saihestu kofaktore endogenoak (biotina, esaterako) erabiltzea hondoa murrizteko, edo oso perturbatzaileak diren erreaktibo exogenoak (adibidez, peroxidoak) erabili zelulen esposizioa ingurumeneko estresarekiko esposizioa minimizatzeko.
Fotosensibilizatzaileak bi kategoriatan bana daitezke: pisu molekular txikiko fluoroforoak (adibidez, arrosa bengala, metileno urdina)22 eta genetikoki kodetutako proteina txikiak (adibidez, miniSOG, KillerRed)23.Diseinu modularra lortzeko, lehen belaunaldiko PDPL plataforma garatu genuen POI24,25 fotosensibilizatzaile (PS) proteinak gehituz (1a irudia).Argi urdinarekin irradiatzen denean, oxigeno singletek aminoazido nukleofiliko proximalen hondakinak oxidatzen ditu, elektrofiloa den polaritate umpolung bat sortzen du eta amin-zundako nukleofiloekin gehiago erreakzionatu dezake16,17.Zunda alkino helduleku batekin diseinatuta dago klik-kimika ahalbidetzeko eta LC/MS/MS karakterizatzeko behera botatzeko.
MiniSOG-ren bidez bitarteko proteina-konplexuen etiketatzearen ilustrazio eskematikoa.Argi urdinaren eraginpean daudenean, miniSOG-POI adierazten duten zelulek oxigeno singletea sortzen dute, eta horrek elkarreraginean dauden proteinak aldatzen ditu, baina ez lotzen diren proteinak.Fotooxidazioaren bitarteko produktuak amina-zunda kimikoaren errele-etiketek atzematen dituzte aduktu kobalenteak sortzeko.Kimika-zundako alkinilo taldeak klik-kimikaren bidez aberasteko aukera ematen du, eta jarraian LC-MS/MS kuantifikazioaren bidez aberasteko.b 1-4 amina-zunden egitura kimikoa.c Gel fluoreszenteen analisi adierazgarria, lokalizatutako miniSOG bidezko markatzaile proteomiko mitokondrialen 1-4 zundak erabiliz eta gel-densitometrian oinarritutako kuantifikazio erlatiboa erabiliz.Zunda kimikoen seinalearen eta hondoaren arteko erlazioa argi urdina kenduta edo miniSOG adierazpenik gabeko HEK293T zelulak erabiliz kontrol negatiboko esperimentuak erabiliz ebaluatu zen.n = 2 lagin biologikoki independenteak.Puntu bakoitzak erreplika biologiko bat adierazten du.d PDPLren detekzio eta kuantifikazio adierazgarria 3. zunda optimizatua erabiliz, adierazitako PDPL osagaien presentzian edo ezean c.n = 3 lagin biologikoki independenteak.Puntu bakoitzak erreplika biologiko bat adierazten du.Erdiguneek eta biboteek batez bestekoa eta ± desbideratze estandarra adierazten dute.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Oxigeno singletaren irudi konfokala Si-DMA orban gorri urrunarekin.Eskala barra: 10 µm.Gelaren irudiak eta esperimentu konfokalak modu independentean errepikatu ziren gutxienez bi aldiz antzeko emaitzekin.
Lehenik eta behin, miniSOG26 eta KillerRed23 fotosensibilizatzaile helduek, HEK293T-n modu egonkorrean adieraziak, proteomaren propargilamina etiketatzea zunda kimiko gisa bideratzeko duten gaitasuna probatu genuen (1a irudi osagarria).Gelaren fluoreszentzia-analisiak erakutsi zuen proteoma osoa etiketatzea miniSOG eta argi urdinaren irradiazioa erabiliz lortu zela, KillerRed-ekin etiketatze-produkturik ikusten ez zen bitartean.Seinalearen eta hondoaren arteko erlazioa hobetzeko, anilina (1 eta 3), propilamina (2) edo benzilamina (4) duten zunda kimiko multzo bat probatu genuen.Ikusi genuen HEK293T zelulek beraiek atzeko seinale handiagoa zutela atzeko argi urdinarekin alderatuta, ziurrenik erriboflabina fotosensibilizatzaile endogenoaren ondorioz, flavin mononukleotidoa (FMN) 27 . Anilinan oinarritutako 1. eta 3. zunda kimikoek espezifikotasun hobea eman zuten, HEK293T-k mitokondrioetan miniSOG modu egonkorrean adieraziz 3. zundaren seinalearen >8 aldiz handitu zuen, eta 2. zunda RNA-etiketatzeko metodoan CAP-seq-ek ~ 2.5- bakarrik erakusten zuen bitartean. tolestu seinalea handitzea, ziurrenik RNAren eta proteinaren arteko erreaktibotasun hobespen desberdinengatik (1b, c. irudiak). Anilinan oinarritutako 1. eta 3. zunda kimikoek espezifikotasun hobea eman zuten, HEK293T-k mitokondrioetan miniSOG modu egonkorrean adieraziz 3. zundaren seinalearen >8 aldiz handitu zuen, eta 2. zunda RNA-etiketatzeko metodoan CAP-seq-ek ~ 2.5- bakarrik erakusten zuen bitartean. tolestu seinalea handitzea, ziurrenik RNAren eta proteinaren arteko erreaktibotasun hobespen desberdinengatik (1b, c. irudiak).Anilinan oinarritutako 1. eta 3. zunda kimikoek espezifikotasun hobea erakutsi zuten: HEK293T-k, mitokondrioetan miniSOG egonkorra adierazten duena, 3. zundarako seinalea 8 aldiz gehiago erakusten du, eta 2. zunda, CAP-seq RNA etiketatze metodoan erabiltzen den bitartean, soilik. ~ 2,5 aldiz seinalearen hazkundea erakusten du, ziurrenik RNAren eta proteinaren arteko erreaktibotasun hobespen desberdinengatik (1b, c. irudiak).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性, HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minisog, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 而 用 于 RNA 标记 方法 Cap-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性, HEK293T 在 粒体 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 增加 增加 增加 增加 增加 增加 增加 于 于 于 标记 标记 标记 标记 2 标记 Cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilinan oinarritutako 1. eta 3. zunda kimikoek espezifikotasun hobea zuten, HEK293T-k modu egonkorrean adierazi zuen miniSOG mitokondrioetan eta 3. zundak seinalea 8 aldiz gehiago izan zuen, eta CAP-seq RNA etiketatze metodorako 2. zundak ~ 2,5 aldiz baino ez zuen hazi.seinalean, ziurrenik RNA eta proteinaren arteko erreakzio-hobespen ezberdinengatik (1b, c. irudia).Horrez gain, 3. zunda isomeroak eta hidrazina zundak (5, 6, 7 zundak) probatu ziren, 3. zundaren optimizazioa baieztatuz (1b, c irudi osagarria).Era berean, gel-eko fluoreszentzia-analisiak beste parametro esperimental optimizatuak agerian utzi zituen: irradiazio-uhin-luzera (460 nm), zunda kimikoen kontzentrazioa (1 mM) eta irradiazio-denbora (20 min) (2a-c irudi osagarria).PDPL protokoloan edozein osagai edo urrats baztertzeak seinalea atzeko planoan itzulera handia ekarri zuen (1d. irudia).Nabarmentzekoa, proteina etiketatzea nabarmen murriztu zen sodio azida edo troloxaren presentzian, zeinak ezagutzen diren oxigeno singlet itzaltzen dutela.D2O presentziak, hau da, oxigeno singlet egonkortzen duela, etiketatze seinalea hobetzen du.Beste oxigeno-espezie erreaktibo batzuek etiketatzeko duten ekarpena ikertzeko, manitol eta C bitamina gehitu ziren hidroxilo eta superoxido erradikal-erradikalak ezartzeko, hurrenez hurren, 18, 29, baina ez zen etiketatzea murrizten zutenik aurkitu.H2O2 gehitzeak, baina ez argiztapenak, ez zuen etiketarik eragin (3a irudi osagarria).Fluoreszentzia singlet oxigenoaren irudiak Si-DMA zundekin oxigeno singlet presentzia baieztatu zuen HEK293T-miniSOG alanbrean, baina ez jatorrizko HEK293T alanbrean.Horrez gain, mitoSOX Red-ek ezin izan zuen superoxido-ekoizpena detektatu argiztapenaren ondoren (1e irudia eta 3b irudi osagarria) 30. Datu hauek oso iradokitzen dute oxigeno singlet-a dela ondorengo etiketatze proteomikoaren ardura duen oxigeno-espezie erreaktibo nagusia.PDPLren zitotoxikotasuna argi urdinaren irradiazioa eta zunda kimikoak barne ebaluatu ziren, eta ez zen zitotoxikotasun esanguratsurik ikusi (4a irudi osagarria).
Etiketatze-mekanismoa aztertzeko eta proteina-konplexuen identifikazio proteomikoa ahalbidetzeko LC-MS/MS erabiliz, lehenik eta behin zein aminoazido aldatzen diren eta zunda-etiketen delta-masa zehaztu behar dugu.Metionina, histidina, triptofanoa eta tirosina oxigeno singletaren bidez aldatzen direla jakinarazi da14,15.TOP-ABPP31 lan-fluxua MSFragger32-n oinarritutako FragPipe informatika plataformak eskaintzen duen bilaketa ireki alboragarriarekin integratzen dugu.Oxigeno singletaren aldaketa eta zunda kimikoak etiketatu ondoren, klik-kimika egin zen lokailu zatigarri bat zuen biotina murrizteko etiketa erabiliz, neutrabidina luzatzea eta tripsina digestioa erabiliz.Eraldatutako peptidoa, oraindik erretxinari lotuta, fotomoztu egin zen LC-MS/MS analisirako (2a irudia eta datu osagarriak 1).Aldaketa ugari gertatu ziren proteoman zehar 50 peptido-mapa (PSM) partida baino gehiago zerrendatuta (2b. irudia).Harrigarria bada ere, histidinaren aldaketa besterik ez dugu ikusi, ziurrenik histidinak oxidatutako anilina zundekiko beste aminoazido batzuek baino erreaktibotasun handiagoa duelako.Oxigeno singletearen bidez histidina oxidatzeko mekanismoaren arabera, 21,33 proposatzen den +229 Da-ren delta-masa egitura 3. zunda 2-oxo-histidinarekin bi oxidazioren ondoren aduktuari dagokio, +247 Da hidrolisi-produktua den bitartean. +229 Da (5. irudi osagarria).MS2 espektroaren ebaluazioak y eta b ioi gehienen identifikazioaren fidagarritasun handia erakutsi zuen, zati-ioi eraldatuen identifikazioa barne (y eta b) (2c. irudia).PDPL-k eraldatutako histidinen tokiko sekuentziaren testuinguruaren analisiak motibo hobespen moderatua agerian utzi zuen ± 1 posizioetan hondar hidrofobo txikietarako (4b irudi osagarria).Batez beste, 1,4 histidina identifikatu ziren proteina bakoitzeko, eta markatzaile horien guneak disolbatzaileen azalera irisgarriaren (SASA) eta disolbatzaileen erabilgarritasun erlatiboaren (RSA) analisiaren bidez zehaztu ziren (4c, d irudi osagarria).
Alborapenik gabeko lan-fluxua MSFragger-ek bultzatutako FragPipe informatika plataforma erabiliz hondar selektibitatea aztertzeko.Lokagailu zatigarriak Click kimikan erabiltzen dira estreptavidin erretxinatik eraldatutako peptidoen fotomozketa ahalbidetzeko.Bilaketa irekia egin zen aldaketa ugari identifikatzeko, baita aztarna garrantzitsuak ere.b Esleitu proteoma osoan gertatzen diren aldaketen masa.PSM peptidoen mapaketa.c 3. zundarekin eraldatutako histidina guneen MS2 oharpen espektrala. Adibide adierazgarri gisa, 3. zundarekin erreakzio kobalente batek +229,0938 Da gehitu zion eraldatutako aminoazidoari.d PDPL markatzaileak probatzeko erabiltzen den mutazio-saioa.PRDX3 (H155A, H225A) eta PRDX1 (H10A, H81A, H169A) basati motako plasmidoekin transfektatu ziren Bandaren aurkako detektatzeko.e Peptido sintetikoa miniSOG araztuarekin erreakzionatu zen 3. zundaren aurrean eta Δm +247 eta +229 duten produktuak LC-MS espektroan adierazi ziren.f MiniSOG-6xHis-tag-ekin eta anti-6xHis antigorputzekin modelatutako in vitro proteinaren arteko elkarrekintzak.3. zundarekin etiketatutako miniSOG-6xHis/anti-6xHis antigorputz konplexuen antibiotina (streptavidin-HRP) eta saguaren aurkako Western blot analisia, argiaren esposizio denboraren arabera.Proteinen etiketak dagokien pisu molekularrean adierazten dira: LC antigorputz kate arina, HC antigorputz kate astuna.Esperimentu hauek modu independentean errepikatu ziren gutxienez bi aldiz antzeko emaitzekin.
Etiketatze-gunearen egiaztapen biokimikorako, masa-espektrometriaren bidez identifikatutako PRDX3 eta PRDX1 histidinatik alaninara aldatu ziren eta transfekzio-saioetan basatiarekin alderatu ziren.PDPL emaitzek erakutsi zuten mutazioak etiketaketa nabarmen murriztu zuela (2d. irudia).Bien bitartean, bilaketa irekian identifikatutako peptido-sekuentziak sintetizatu eta in vitro miniSOG araztuarekin erreakzionatu ziren 3. zunda eta argi urdinaren aurrean, +247 eta +229 Da-ko masa-aldaketa duten produktuak emanez LC-MS bidez detektatzean (Irudia . 2e).).MiniSOG fotoaktibazioari erantzunez elkarreraginean dauden proteinak in vitro etiketatu daitezkeen ala ez probatzeko, hurbiltasun-saio artifizial bat diseinatu dugu miniSOG-6xHis proteinaren eta in vitro antigorputz monoklonal baten kontrako elkarreraginaren bidez (2f irudia).Entsegu honetan, antigorputz kate astun eta arinak etiketatzea espero genuen miniSOG-rekin.Izan ere, saguaren aurkako (6xHis-en aurkako antigorputz markadunen kate astunak eta arinak aintzat hartuta) eta streptavidin Western blots-ek kate astun eta arinen biotinilazio handia erakutsi zuten.Nabarmentzekoa, miniSOG autobiotinilazioa nabaritu dugu 6xHis etiketaren eta kate arin eta astunen arteko lotura gurutzatuak direla eta, aurretik deskribatutako lisina eta 2-oxo-histidina erantzun proximalaren arteko hutsunearekin erlazionatuta egon daitekeelarik.Bukatzeko, PDPLk histidina hurbiltasunaren menpeko era aldatzen duela ondorioztatzen dugu.
Gure hurrengo helburua proteoma azpizelularra karakterizatzea izan zen, in situ etiketatzearen espezifikotasuna probatzeko.Hori dela eta, miniSOG modu egonkorrean adierazi genuen HEK293T zelulen nukleoan, matrize mitokondrialean edo kanpoko ER mintzean (3a. irudia).Gelaren fluoreszentzia-analisiak etiketatutako banda ugariak agerian utzi zituen hiru kokapen azpizeluletan, baita etiketatze eredu desberdinak ere (3b. irudia).Fluoreszentzia irudien analisiak PDPLren espezifikotasun handia erakutsi zuen (3c. irudia).PDPL lan-fluxuari klik-erreakzioak jarraitu ziren rodamina koloratzaileekin proteomak zelular azpian zehaztea fluoreszentzia-mikroskopia erabiliz, eta PDPL seinaleak DAPI, mitokondrial jarraitzaile edo ER jarraitzaileekin kolokanizatu ziren, PDPLren fideltasun handia baieztatuz.Hiru organuluen kokapenetarako, PDPL-ren albo-alboko alderaketa batek avidin western blot erabiliz TurboID-ekin erakutsi zuen PDPL zehatzago etiketatu zela dagozkien kontrolekin alderatuta.PDPL baldintzetan, etiketatutako banda gehiago agertu ziren, PDPL markatutako proteina gehiago adieraziz (6a-d irudi osagarria).
a miniSOG bidezko organuloen proteomaren etiketatze espezifikoaren irudikapen eskematikoa.miniSOG-k matrize mitokondriala fusioaren bidez bideratzen du giza COX4 (mito-miniSOG) N-terminaleko 23 aminoazidoetara, nukleoa H2B (nukleo-miniSOG) fusioaren bidez eta Sec61β ER mintzaren alde zitoplasmikoaren bidez (ER-miniSOG). ).Adierazpenen artean, gel-irudiak, irudi konfokalak eta masa-espektrometria daude.b Organulu espezifikoen hiru PDPL profilen gel irudi adierazgarriak.CBB Coomassie Urdin Distiratsua.c HEK293T zelulen irudi konfokal adierazgarriak miniSOG modu egonkorrean adierazten duten V5 (gorria) markatutako antigorputzek detektatutako lokalizazio azpizelular ezberdinekin.Markagailu azpizelularrak mitokondrioetarako eta ERrako erabiltzen dira (berdea).PDPL lan-fluxuak miniSOG (horia) etiketatutako proteoma azpizelularrak detektatzen ditu Cy3-azide klik-kimika erabiliz.Eskala barra: 10 µm.d Etiketarik gabeko kuantifikazioaren bidez kuantifikatutako hainbat organulutan PDPL markatutako proteomen diagrama bolkanikoak (n = 3 esperimentu biologiko independente).Student bi buztanen t-testa sumendien lursailetan erabili zen.HEK293T basati mota kontrol negatibo gisa erabili zen. Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitate-aldea). Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitate-aldea). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интесви в интесо). Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitatean).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей ионлей). Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz indar ionikoaren aldea).Berdez agertzen dira HEK293T-miniSOGrentzat garrantzitsuak diren baina HEK293Trentzat garrantzitsuak ez diren erlazionatutako proteinak.e Esperimentuetako datu-multzo proteomikoen espezifikotasunaren analisia d.Organulu bakoitzeko proteina estatistikoki esanguratsuen kopuru osoa (puntu gorriak eta berdeak) goialdean markatuta dago.Histogramek organuluetan kokatutako proteinak erakusten dituzte MitoCarta 3.0, GO analisian eta A. Ting et al.jendea.Mitokondrioen, nukleoen eta ERren datu multzo bereiziak.Esperimentu hauek modu independentean errepikatu ziren gutxienez bi aldiz antzeko emaitzekin.Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.
Gelaren eta irudien emaitzek bultzatuta, etiketarik gabeko kuantifikazioa erabili zen organulu bakoitzean identifikatutako proteoma kuantifikatzeko (2. datu osagarriak).Transfektatu gabeko HEK293T kontrol negatibo gisa erabili zen atzeko markatzaileak kentzeko. Sumendien diagrama-analisiak nabarmen aberastutako proteinak (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitatea) eta miniSOG adierazteko lerroetan soilik dauden proteina singletonak (3d. irudia puntu gorri eta berdeak) erakutsi zituen. Sumendien diagrama-analisiak nabarmen aberastutako proteinak (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitatea) eta miniSOG adierazteko lerroetan soilik dauden proteina singletonak (3d. irudia puntu gorri eta berdeak) erakutsi zituen. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Sumendien diagrama-analisiak nabarmen aberastutako proteinak (p<0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitatea) eta miniSOG adierazteko lerroetan soilik dauden proteina bakarrekoak (3d. irudia, puntu gorriak eta berdeak) erakutsi zituen.火山 图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 (P <0,05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 (图 3D 红色 和 绿色点).火山 图 分析 显示 出 显着 的 的 (P <0,05 和> 2 倍 离子离子) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Sumendien grafikoen analisiak nabarmen aberastutako proteinak (p<0,05 eta > 2x indar ionikoa) eta miniSOG adierazpen-lerroan soilik dauden proteina bakarrak (3d irudian puntu gorri eta berdeak) agerian utzi zituen.Datu hauek konbinatuz, 1364, 461 eta 911 estatistikoki esanguratsuak diren nuklear, mitokondrial eta ER kanpoko mintzaren proteina identifikatu ditugu, hurrenez hurren.Organuluetan lokalizatutako PDPLren zehaztasuna aztertzeko, MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analisia eta A. Ting et al.datu-multzo bat8 erabili zen mitokondrioetarako, nukleorako eta ERrako detektatutako proteinen organulu espezifikotasuna probatzeko, % 73,4, 78,5 eta 73,0ko zehaztasunari dagokiona (3e. irudia).PDPLren espezifikotasunak berresten du PDPL tresna ezin hobea dela organulu-proteoma espezifikoak identifikatzeko.Nabarmentzeko, identifikatutako proteina mitokondrialen azterketa submitokondrialak erakutsi zuen harrapatutako proteoma matrizean eta barne-mintzean (226 eta 106, hurrenez hurren) banatuta zegoela, identifikatutako proteina mitokondrial guztien % 91,7 (362).PDPL maila altua ere baieztatu zen (7a irudi osagarria).Era berean, analisi azpinuklearrak erakutsi zuen harrapatutako proteoma batez ere nukleoan, nukleoplasman eta nukleoan banatuta zegoela (7b irudi osagarria).Nuklear lokalizazio-seinale peptidoarekin (3xNLS) analisi proteomiko nuklearrak H2B eraikuntzaren antzeko zehaztasuna erakutsi zuen (7c-h irudi osagarria).PDPL markatzailearen espezifikotasuna zehazteko, A laminina nuklearra POI7 tranpa modu diskretuagoan kokatuta aukeratu zen.PDPL-k nabarmen aberastutako 36 proteina identifikatu zituen, eta horietatik 12 proteina (% 30,0 lamina barne) String datu-baseak ohartarazitako lamin A interakzionatzen duten proteinak ongi karakterizatutakoak ziren, BioID metodoa (122 proteina) baino ehuneko handiagoarekin 28/28. , 22,9. %) 7. Gure metodoak proteina gutxiago identifikatu zituen, ziurrenik etiketatze-eremu mugatuengatik, oxigeno singlet aktiboagoarekin posible izan zena.GO azterketak erakutsi zuen identifikatutako proteinak batez ere nukleoplasman (26), mintz nuklearrean (10), mintz nuklearrean (9) eta poro nuklearretan (5) kokatzen zirela.Kolektiboki, nuklear lokalizatutako proteina hauek aberastutako proteinen % 80 ziren, PDPLren espezifikotasuna gehiago frogatuz (8a-d irudi osagarria).
PDPL-k organuluetan hurbiltasun-markak egiteko duen gaitasuna ezarrita, gero probatu genuen PDPL POI lotze-bazkideak aztertzeko erabil zitekeen.Hain zuzen ere, proteina zitosolikoen PDPL analisia definitu nahi izan dugu, mintzean lokalizatutako parekoak baino helburu zailagotzat hartzen direnak izaera oso dinamikoagatik.Bromodomain and extraterminal (BET) proteinak BRD4 gure arreta erakarri du hainbat gaixotasunetan duen zeregin gakoagatik 35, 36 .BRD4k osatutako konplexua transkripzio-koaktibatzaile bat da eta helburu terapeutiko garrantzitsua da.C-myc eta Wnt5a transkripzio-faktoreen adierazpena erregulatuz, BRD4 leuzemia mieloide akutuaren (AML), mieloma anizkoitzaren, Burkitt-en linfomaren, koloneko minbiziaren eta hanturazko gaixotasunen funtsezko faktorea da37,38.Horrez gain, birus batzuek BRD4 helburu dute transkripzio birikoa eta zelularra erregulatzeko, hala nola papillomabirusa, GIBa eta SARS-CoV-236,39.
PDPL erabiliz BRD4 interakzioa mapatzeko, miniSOG BRD4-ren N- edo C-terminal isoforma labur batekin konbinatu dugu.Proteomiko emaitzek bi konstrukzioen arteko gainjartze-maila handia erakutsi zuten (9a irudi osagarria).MiniSOG-H2B-rekin identifikatutako proteoma nuklearrak BRD4rekin elkarreraginean dauden proteinen % 77,6 estaltzen du (9b irudi osagarria).Ondoren, argiztapen denbora desberdinak (2, 5, 10, 20 min) erabili ziren markatzailearen erradioa doitzeko (4a. irudia eta 3. datu osagarriak).Ondorioztatu dugu fotoperiodo laburragoetan, PDPL-k batik bat lotura zuzeneko bazkideak etiketatuko dituela, eta epe luzeagoetan fotoaktibazio-aldi laburragoetan identifikatutako proteinak eta etiketatze-konplexuetan zeharkako helburuak barne hartuko dituela.Izan ere, ondoko denbora-puntuen arteko gainjartze handia aurkitu dugu (% 84,6 2 eta 5 min; % 87,7 5 eta 10 min; % 98,7 10 eta 20 min) (4b irudia eta 9c irudi osagarria).Talde esperimental guztietan, BRD4 autoetiketatzeaz gain, kateen datu-basean ohartarazitako MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A eta HMGB1 bezalako hainbat helburu ezagun aurkitu ditugu.Helburu horien indar ionikoa esposizio-denboraren proportzionala da (4c irudia eta 9d irudi osagarria).2 minutuko taldean identifikatutako proteinen GO azterketak erakutsi zuen identifikatutako proteinak nukleoan kokatuta zeudela eta kromatina birmoldatzean eta RNA polimerasaren funtzioan parte hartzen zutela.Proteinaren funtzio molekularra kromatinaren loturan edo transkripzio koaktibazioan aberastu zen, BRD4 funtzioarekin bat (4d. irudia).String-en datu-baseak gaituta dauden proteinen interakzio-analisiak BRD4 eta HDAC familiako elkarreragin konplexuen arteko zeharkako interakzioen lehen maila agerian utzi zuen, hala nola SIN3A, NCOR2, BCOR eta SAP130 (4e irudia eta 9e irudi osagarria), BRD4 eta HDAC lotzen dituzten histonak azetilatuekin bat. ..Gainera, LC-MS/MS-k identifikatutako helburu adierazgarriak, Sin3A, NSUN2, Fus eta SFPQ barne, Western blotting bidez baieztatu ziren (4f. irudia).Berriki, BRD4-ren isoforma laburrak fase likido-likidoen bereizketa (LLPS) propietateak dituzten nukleoak eratzen dituela jakinarazi da.Fus eta SFPQ ARN lotzeko proteinak hainbat prozesu zelularren LLPSren bitartekaritza egiten dute eta hemen erregistratu gabeko BRD4 lotze proteina gisa identifikatu dira.BRD4 eta SFPQ-ren arteko elkarrekintza ko-immunoprecipitation (co-IP) esperimentuek (4g irudia) baieztatu zuten, BRD4-k bitarteko likido-likido fasea bereizteko beste mekanismo bat iradokiz ikerketa gehiago merezi zuela.Emaitza hauek elkarrekin hartuta, PDPL plataforma ezin hobea dela iradokitzen dute BRD4 elkarreragin ezagunak eta lotze-proteina ezezagunak identifikatzeko.
a MiniSOG bidezko BRD4 hurbiltasun-markaren irudikapen eskematikoa, esposizio-denborak: 2, 5, 10 eta 20 min.b Argiztapen-une desberdinetan identifikatutako proteinen gainjartzea.HEK293T-miniSOG-BRD4-n identifikatutako proteina aberastea estatistikoki esanguratsua izan zen HEK293T basatiarekin alderatuta.c Ioi-intentsitatea zehaztu gabeko esposizio-denboran BRD4 lotze-proteina ezagunak adierazgarriak kuantifikatzean.n = 3 lagin biologikoki independenteak.Datuak batez besteko ± desbideratze estandar gisa aurkezten dira.d 2 minutuko taldean identifikatutako proteinen gene-analisi ontologikoa (GO).Lehenengo hamar GO terminoak zerrendatzen dira.Burbuilak GO termino-kategoriaren arabera margotzen dira, eta burbuilen tamaina termino bakoitzean aurkitutako proteina-kopuruarekiko proportzionala da.e BRD4rekin elkarreraginean dauden proteinen kateen analisia.Zirkulu horiak kola zuzena dira eta zirkulu grisak zeharkako kolaren lehen geruza.Lerro gorriak esperimentalki zehaztutako elkarrekintzak adierazten ditu eta marra urdinek aurreikusitako elkarrekintzak.f LC-MS/MSn identifikatutako BRD4 lotespen-helburu adierazgarriak Western blot bidez egiaztatu ziren.g Ko-immunoprecipitation esperimentuek SFPQ eta BRD4-ren arteko elkarrekintza berresten dute.Esperimentu hauek modu independentean errepikatu ziren gutxienez bi aldiz antzeko emaitzekin.Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.
Erregistratu gabeko POI-rekin lotutako helburuak identifikatzeaz gain, hipotesia dugu PDPL egokia izango dela entzimetarako substratuak identifikatzeko, eta horrek konplexu handietan zeharkako lotura-proteinen karakterizazioa eskatuko luke erregistratu gabeko substratuak anotatzeko.Parkina (PARK2-k kodetuta) E3 ligasa bat da eta parkinaren mutazioek Parkinson gazteen gaixotasun autosomiko recesiboa (AR-JP) eragiten dutela ezagutzen da42.Horrez gain, parkina ezinbestekoa dela deskribatu da mitofagiarako (autofagia mitokondriala) eta oxigeno-espezie erreaktiboak kentzeko.Hala ere, parkinen substratu batzuk identifikatu diren arren, parkinak gaixotasun honetan duen eginkizuna ez dago argi.Bere ezaugarririk gabeko substratuak ohartzeko, PDPL probatu zen parkinaren N- edo C-muinean miniSOG gehituz.Zelulak karbonilo zianuro protoi garraiatzailearekin (CCCP) tratatu ziren PINK1-Parkin bidearen bidez parkina aktibatzeko.Gure BRD4 PDPL emaitzekin alderatuta, parkin N-termins fusioak xede-proteina multzo handiagoa agerian utzi zuen, nahiz eta C-terminalaren zati handiagoa estaltzen zuen (210etik 177) (5a, b irudia eta datu osagarriak 4).emaitza koherentea da N-terminaleko etiketak Parkin44 modu okerrean aktibatu ditzaketen txostenekin.Harrigarria bada ere, gure datuetan 18 proteina gainjarri baino ez zeuden Parkin43rako argitaratutako AP-MS emaitzekin, ziurrenik zelula-lerroen eta proteomikaren lan-fluxuen arteko desberdintasunengatik.Bi metodoren bidez identifikatutako lau proteina ezagunez gain (ARDM1, HSPA8, PSMD14 eta PSMC3) (5c. irudia)43.LC-MS/MSren emaitzak gehiago balioztatzeko, PDPL tratamendua eta ondorengo Western blotting erabili ziren HEK293T zelula gurasoen entseguaren emaitzak eta N-terminal parkin lerro egonkorra konparatzeko.Aurretik ezezagunak diren CDK2, DUT, CTBP1 eta PSMC4 lotzaile ezagun batekin probatu ziren, DNAJB1 (5d. irudia).
Parkinarekin elkarreraginean dauden proteinen sumendien grafikoa HEK293T zeluletan adierazitako miniSOG egonkorrean parkinaren N- edo C-muturrarekin fusionatuta (n = 3 esperimentu biologiko independente).Student bi buztanen t-testa sumendien lursailetan erabili zen.HEK293T kontrol negatibo gisa erabili zen. Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitate-aldea). Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitate-aldea). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интесви в интесо). Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz ioien intentsitatean).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей ионлей). Nabarmen aldatutako proteinak gorriz nabarmentzen dira (p < 0,05 eta > 2 aldiz indar ionikoaren aldea).Berdez agertzen dira HEK293T-miniSOGrentzat garrantzitsuak diren baina HEK293Trentzat garrantzitsuak ez diren erlazionatutako proteinak.b Venn diagrama N-terminalaren eta C-terminalaren konstrukzioen artean gainjarritako proteinak erakusten dituena.N-terminaleko etiketak modu aberrantean aktibatu ditzakete parkina eta proteina ezagutagarriagoak sor ditzakete.c Venn diagrama PDPL eta AP-MS arteko proteinak gainjarriz erakusten dituena.Ezagunak diren elkarreragileak zerrendatzen dira, gainjarritako 18 proteinatik 4 eta PDPLn zehazki identifikatutako 159 proteinatik 11 barne.d LC-MS/MS bidez identifikatutako helburu adierazgarriak Western blotting bidez egiaztatu ziren.e Ssu72 eta SNW1 erregistratu gabeko parkin substratu gisa identifikatu ziren.FLAG markadun proteina-plasmido hauek HEK293T eta HEK293T-Parkin-miniSOG-ra transfektatu ziren eta ondoren CCCP tratamendua egin zuten hainbat momentutan.Degradazioa nabarmenagoa izan zen Parkinaren gainespresio lerroan.f MG132 proteasomaren inhibitzailea erabiliz, Ssu72 eta SNW1-en degradazio-prozesua proteasoma-ubiquitination bidezkoa dela baieztatu zen.Esperimentu hauek modu independentean errepikatu ziren gutxienez bi aldiz antzeko emaitzekin.Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.
Nabarmentzekoa, PDPLk identifikatutako proteinek parkinarekin lotzen dituzten proteinak eta haien substratuak izan behar dituzte.Erregistratu gabeko parkinen substratuak detektatzeko, identifikatutako zazpi proteina (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 eta SNW1) eta transfektatutako plasmidoak aukeratu genituen gene hauek HEK293T normaletara erakusteko eta miniSOG-Parkin-en HEK293T tratamendua egonkorki adierazteko CCCP tratamendua jarraituz.Ssu72 eta SNW1 proteinen mailak nabarmen murriztu ziren miniSOG-Parkin lerro egonkorrean (5e. irudia).CCCPrekin 12 orduko tratamenduak bi substratuen degradaziorik nabarmenena eragin zuen.Ssu72 eta SNW1-en degradazioa proteasom-ubikitinazioaren bidez erregulatzen den ikertzeko, MG132 proteasomaren inhibitzailea gehitu zen proteasomaren jarduera inhibitzeko, eta, hain zuzen, haien degradazio-prozesua inhibituta zegoela ikusi genuen (5f. irudia).Substratu gabeko helburu osagarriak Parkin interaktore gisa baieztatu ziren Western blotting erabiliz (10. irudi osagarria), eta emaitza koherenteak erakutsi zituzten LC-MS/MS-rekin.Ondorioz, PDPL lan-fluxua xede proteina transfekzioaren egiaztapenarekin integratzeak erregistratu gabeko E3 ligasaren substratuak identifikatzea ahalbidetzen du.
Gertutasun-markatzeko plataforma komun bat garatu dugu, espazioan eta denboran elkarreraginean dauden POI-ak identifikatzeko aukera ematen duena.Plataforma miniSOG fotosensibilizatzaile proteinan oinarritzen da, hau da, 12 kDa ingurukoa, APEX2 entzima helduaren tamainaren erdia baino gutxiago (27 kDa) eta TurboID-en tamainaren herena (35 kDa).Tamaina txikiagoak asko zabaldu beharko luke proteina txikien interaktoma aztertzeko aplikazioen aukera.Fotosensibilizatzaile gehigarrien esplorazio gehiago behar da, genetikoki kodetutako proteinak edo molekula txikiak izan, oxigeno singletaren etekin kuantikoa areagotzeko eta ikuspegi honen sentikortasuna zabaltzeko.MiniSOGren egungo bertsiorako, denbora-bereizmen handia lor daiteke argiztapen urdina erabiliz hurbiltasun-markatzaileak aktibatzeko.Horrez gain, esposizio-denbora luzeagoek oxigeno singlet "hodei" handiagoa askatu zuen, eta ondorioz histidina-hondakin distalagoak aldatzea, etiketa-erradioa handitzea eta PDPL bereizmen espaziala doitzeko gaitasuna izan zuen.Zazpi zunda kimiko ere probatu genituen seinalearen eta hondoaren arteko erlazioa handitzeko eta ikuspegi honen atzean dagoen mekanismo molekularra aztertu genuen.TOP-ABPP lan-fluxuak bilaketa ireki gabeko alborapenarekin konbinatuta histidinetan bakarrik gertatu zirela eta ez zen mikroingurune koherenterik ikusi histidinaren aldaketetarako, begiztaren eskualdeko histidinak lehentasun moderatua izan ezik.
PDPL ere erabili izan da proteomaren espezifikotasun eta estaldura duten proteomak ezaugarritzeko, hurbiltasun-etiketatzeko eta organulu espezifikoen zundaketa kimikoen metodoekin, gutxienez.Hurbiltasun-markatzaileak ere arrakastaz erabili dira azaleko, lisosomiko eta sekretomei lotutako proteomak karakterizatzeko46,47.Uste dugu PDPL bateragarria izango dela zelula azpiko organulu hauekin.Horrez gain, PDPLri aurre egin genion proteina zitosolikoen loturarako helburuak identifikatuz, mintzarekin loturiko proteinak baino konplexuagoak diren propietate dinamikoengatik eta elkarrekintza denbora gehiagotan parte hartzen dutelako.PDPL bi proteinari aplikatu zen, BRD4 transkripzio koaktibatzaileari eta gaixotasunari lotutako E3 Parkin ligasa.Bi proteina hauek oinarrizko funtzio biologikoengatik ez ezik, garrantzi klinikoagatik eta potentzial terapeutikoagatik ere aukeratu ziren.Bi POI horietarako, bazkide lotesle ezagunak zein erregistratu gabeko helburuak identifikatu ziren.Nabarmentzekoa, fase bereizketari lotutako SFPQ proteina co-IP bidez baieztatu zen, eta horrek BRD4 (isoforma laburrak) LLPS erregulatzen duen mekanismo berri bat adieraz dezake.Aldi berean, uste dugu Parkinaren substratuen identifikazioa zeharkako itsasgarrien identifikazioa behar den eszenatoki bat dela.Identifikatu gabeko bi parkin substratu identifikatu genituen eta haien degradazioa baieztatu genuen ubikitinazio-proteasoma bidetik.Berriki, mekanismoetan oinarritutako harrapaketa-estrategia bat garatu da hidrolasa-substratuak detektatzeko, entzimekin harrapatuz.Oso metodo indartsua den arren, ez da egokia konplexu handien eraketan parte hartzen duten substratuak aztertzeko eta entzimaren eta substratuaren arteko lotura kobalenteak sortzea eskatzen du.Espero dugu PDPL hedatu daitekeela beste proteina-konplexu batzuk eta entzima-familia batzuk aztertzeko, hala nola deubikitinasa eta metaloproteasa-familiak.
MiniSOG forma berri bat, SOPP3 izenekoa, oxigeno singletaren ekoizpen hobetuarekin garatu da.MiniSOG SOPP3-rekin alderatu dugu eta markatze-errendimendu hobetua aurkitu dugu, nahiz eta seinale-zarata erlazioak aldatu gabe egon (11. irudi osagarria).Hipotesi genuen SOPP3 optimizatzeak (adibidez, eboluzio zuzenduaren bidez) proteina fotosensibilizatzaile eraginkorragoak izatea ekarriko lukeela, argi-denbora laburragoak behar dituztenak eta, beraz, prozesu zelular dinamikoagoak harrapatzeko aukera emango lukeela.Nabarmentzekoa, PDPLren egungo bertsioa ingurune zelularra mugatzen da, argi urdinaren argiztapena behar duelako eta ezin duelako ehun sakonetan sartu.Ezaugarri honek animalia-ereduen ikerketetan erabiltzea galarazten du.Hala ere, optogenetika PDPLarekin konbinatzeak animalien ikerketarako aukera eman dezake, batez ere garunean.Gainera, ingeniaritza infragorrien beste fotosensibilizatzaile batzuek ere muga hori kentzen dute.Gaur egun ikerketak egiten ari dira arlo honetan.
HEK293T zelula-lerroa ATCCtik (CRL-3216) lortu zen.Zelula-lerroa negatiboa izan zen mikoplasmaren infekziorako eta DMEM-n (Thermo, # C11995500BT) fetuaren % 10eko behi-serumarekin (FBS, Vistech, # SE100-B) eta % 1eko penizilina/estreptomizina (Hyclone, # SV30010) osatutako DMEM-n hazi zen.urtean hazi.
Bidepharm-i 3-aminofenilenoa (3. lagina) eta (4-etinilfenil) metanamina (4. lagina) erosi ziren.Propilamina (2. zunda) Energy-chemicals-en erosi zen.N-(2-Aminophenyl)pent-4-inamida (1. zunda) argitaratutako metodoen arabera sintetizatu zen.
1. taula osagarriak ikerketa honetan erabilitako eraikuntza genetikoak zerrendatzen ditu.MiniSOG eta KillerRed sekuentziak P. Zou-ren (Pekingo Unibertsitatea) opari plasmido batetik klonatu ziren.Matrize mitokondrialaren xede-sekuentzia COX4-ren 23 N-terminal aminoazidoetatik eratorri zen eta adierazitako bektoreetan klonatu zen Gibson-en muntaia erabiliz (Beyotime, #D7010S).Erretikulu endoplasmikoaren mintza eta nukleoa bideratzeko, SEC61B giza DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T zelulen cDNA liburutegi batetik PCR bidez anplifikatu eta H2B DNA (D. Lin-ek emandakoa, Shenzhen Bay Laboratory) eta klonatua, goian esan bezala.Besterik adierazi ezean, transfekziorako eta zelula-lerro egonkorrak eraikitzeko erabilitako beste proteina-gene batzuk PCR anplifikatu ziren HEK293T zelulen cDNA liburutegitik.G3S (GGGS) eta G4S (GGGGS) beita proteinaren eta miniSOGren arteko lokailu gisa erabili ziren.V5 epitopo etiketa bat (GKPIPNPLLGLDST) gehitu zitzaien fusio-eraikuntza horiei.Ugaztunetan adierazteko eta zelula-lerro egonkorra ezartzeko, miniSOG fusio-konstrukzioa pLX304 bektore lentibiralean azpiklonatu zen.Bakterioen adierazpenerako, miniSOG 6xHis etiketatutako pET21a bektorean klonatu zen C-muturrean.
HEK293T zelulak putzu bakoitzeko 2,0 x 105 zeluletan hazi ziren sei putzuko plaketan eta 24 ordu geroago transfektatu ziren plasmido lentibiral birkonbinatzaileekin (2,4 μg pLX304) eta ontziratze birikoaren plasmidoekin (1,5 μg psPAX2 eta 1,2 μg pMD28000 erabiliz) (LiBepoyo8000) erabiliz (LiBepoyo. , #C0533), %80 inguruko fusioa.Gaueko transfekzioa egin ondoren, medioa aldatu eta beste 24 orduz inkubatu zen.Birusaren bilketa 24, 48 eta 72 orduren buruan egin zen.Xede zelula-lerroak infektatu aurretik, ertain birikoa 0,8 μm-ko iragazki baten bidez iragazi zen (Merck, #millex-GP) eta polibrenoa (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml-ko kontzentraziora gehitu zen.24 ordu igaro ondoren, zelulak suspertzen utzi ziren medioa aldatuz.Zelulak 5 μg/ml blastizidina (Solarbio, # 3513-03-9) erabiliz hautatu ziren lehenengo hiru pasarteetarako hautaketa zorrotz baxuago gisa.Ondoren, 20 μg/ml erabili erregimen zorrotzago gisa hurrengo hiru pasarteetarako.
Zelulak 12 putzuko ganberetan (Ibidi, #81201) hazi ziren, gutxi gorabehera 20.000 zelula hobi bakoitzeko dentsitatean.HEK293T zelulen atxikimendua hobetzeko, gehitu 50 µg/ml fibronektina (Corning, #356008) fosfato tamponatuko gatz salinoan (PBS, Sangon, #B640435) 37 °C-tan diluitua.Ganberak ordubetez aurrez tratatu eta gero PBSarekin kendu ziren.24 ordu igaro ondoren, zelulak behin garbitu ziren PBSarekin, 1 mM zunda 3arekin inkubatu ziren Hanks-en gatz-disoluzio orekatuan (HBSS, Gibco, #14025092) ordubetez 37 °C-tan, eta ondoren LED urdin batekin inkubatu ziren (460 nm). ).) 10 minutuz irradiatu ziren giro-tenperaturan.Horren ostean, zelulak bi aldiz garbitu ziren PBSarekin eta %4ko formaldehidoarekin finkatu ziren PBSn (Sangon, #E672002) 15 minutuz giro-tenperaturan.Gehiegizko formaldehidoa zelula finkoetatik kendu zen hiru aldiz PBSarekin garbituz.Ondoren, zelulak % 0,5 Triton X-100 (Sangon, #A600198) PBSn iragaziztu eta 3 aldiz garbitu ziren PBSarekin.Ondoren, kendu ganbera eta gehitu lagin bakoitzari 50 µM Cy3-azida (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) dituen klik erreakzio-nahasketa baten 25 µl. eta 0,5 mg/ml sodio askorbatoa (Aladdin, zk. S105024) eta giro-tenperaturan 30 minutuz inkubatu.Snap-erreakzio baten ondoren, zelulak sei aldiz garbitu ziren % 0,05 Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) zuen PBSarekin eta, ondoren, %5 BSArekin (Abcone, #B24726) blokeatu ziren PBSTn 30 minutuz giro-tenperaturan.
Kokalizazioaren immunotinketa egiteko, zelulak antigorputz primarioekin inkubatu ziren adierazitako baldintzen arabera: saguaren anti-V5 etiketa mAb (1:500, CST, #80076), untxiaren aurkako Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), untxiaren aurkako antigorputz poliklonala (1:500, Abcam, #ab22595) edo untxiaren aurkako laminaren A/C antigorputz monoklonal (1:500; CST, #2032) 4 °C gauean.PBSTrekin 3 aldiz garbitu ondoren, zelulak bigarren mailako antigorputzekin inkubatu ziren: ahuntz-untxiaren aurkako Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) 1:1000 diluitua, ahuntz-saguaren aurkako Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:1000 diluitua.diluzioa Giro-tenperaturan diluitu 30 minutuz.Ondoren, zelulak 3 aldiz garbitu ziren PBSTrekin eta DAPIrekin (Thermo, # D1306) PBSn kontratandu ziren 10 minutuz giro-tenperaturan.PBSrekin 3 garbiketa egin ondoren, zelulak %50eko glizerolatan (Sangon, #A600232) zigilatu ziren PBSn irudiak egiteko.Irudi immunofluoreszenteak ZEISS LSM 900 Airyscan2 mikroskopio konfokala eta ZNE 3.5 softwarea erabiliz lortu dira.
Oxigeno fluoreszentearen irudi singletetarako, zelulak bi aldiz garbitu ziren Hanks HEPES bufferarekin 100 nM Si-DMA Hanks HEPES tamponean (DOJINDO, #MT05) gehitu aurretik.Argiaren eraginpean egon ondoren, zelulak CO2 inkubagailu batean inkubatu ziren 37 °C-tan 45 minutuz.Gero, zelulak bi aldiz garbitu ziren Hanks-en HEPES bufferarekin eta Hoechst-ekin kontratatu ziren Hanks-en HEPES bufferan 10 minutuz giro-tenperaturan eta ZEISS LSM 900 mikroskopio konfokalarekin bistaratu ziren., #M36008) kaltzioa eta magnesioa dituen HBSS buffer batean.Argia edo doxorrubizina (MCE, #HY-15142A) esposizioaren ondoren, zelulak CO2 inkubagailu batean inkubatu ziren 37° C-tan 10 minutuz, bi aldiz garbitu HBSS bufferarekin eta Hoechst-ekin inkubatu ziren HBSS tamponean giro-tenperaturan.minutu.Doxorubicina zunda kontrol positibo gisa erabili zen, non zelulak %1 BSA zuen HBSS-n 20 μM doxorubicinarekin tratatu ziren 30 minutuz.Irudi immunofluoreszenteak Zeiss LSM 900 mikroskopio konfokala erabiliz lortu dira.
Mito-miniSOG modu egonkorrean adierazten duten HEK293T zelulak gutxi gorabehera % 30eko dentsitatean hazi ziren 15 cm-ko plateretan.48 ordu igaro ondoren, ~% 80ko konfluentziara iritsi zenean, zelulak behin garbitu ziren PBSarekin, 1 mM Probe 3 HBSS buffer freskoarekin inkubatu ziren ordubetez 37 °C-tan eta gero LED urdin batekin argiztatu ziren 10 minutuz gelan. tenperatura..Hortik aurrera, zelulak bi aldiz garbitu ziren PBSarekin, birrinduta eta EDTArik gabeko proteasa inhibitzaileak zituen izotz-hotzean PBS buffer batean (MCE, #HY-K0011).Zelulak puntu 1 minutuz sonikatuz lisatu ziren (segundo 1 piztuta eta segundo 1 itzali % 35eko anplitudean).Lortutako nahasketa 15.871 xg-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 ° C-tan hondakinak kentzeko, eta gainditzaileen kontzentrazioa 4 mg/mL-ra egokitu zen BCA proteina saiatze-kit bat erabiliz (Beyotime, # P0009).Konbinatu goiko lisatuaren 1 ml 0,1 mM biotina azida fotodegradagarriarekin (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligandoarekin (Aladdin, #T162437) eta 1 mM CuSO4 beheko inkubagailuarekin. biraketa ordu 1 giro-tenperaturan.Snap-erreakzio baten ondoren, gehitu nahasketa aurrez nahastutako disoluzioari (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) 10 ml beirazko ontzi batean.Laginak nahastu eta 4500 g-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz giro-tenperaturan.Beheko eta goiko disoluzioak baztertu, prezipitatua bi aldiz garbitu 1 ml metanolarekin eta 15871 × g-tan zentrifugatu zen 5 minutuz 4 °C-tan.Gehitu 1 ml 8 M urea (Aladdin, zk. U111902) 25 mM amonio bikarbonatoan (ABC, Aladdin, zk. A110539) prezipitatua disolbatzeko.Laginak 10 mM ditiotreitolarekin (Sangon, # A100281 25 mM ABC-n) 40 minutuz 55 ° C-tan eratu ziren eta ondoren 15 mM iodoacetamida freskoa gehitu zen (Sangon, # A600539) giro-tenperaturan iluntasunean.Alkilazioa 30 minututan..5 mM ditiotreitol gehigarri bat gehitu zen erreakzioa geldiarazteko.Prestatu gutxi gorabehera 100 µl NeutrAvidin agarosa aleak (Thermo, #29202) lagin bakoitzeko 3 aldiz garbituz 1 ml PBSrekin.Goiko proteoma disoluzioa 5 ml PBSrekin diluitu zen eta aurrez garbitutako NeutrAvidin agarosa aleekin inkubatu zen 4 orduz giro-tenperaturan.Aleak 3 aldiz garbitu ziren %0,2 SDS (Sangon, #A600485) duen 5 ml PBSrekin, 3 aldiz 1M urea zuen 5 ml PBSrekin eta 3 aldiz 5 ml ddH2Orekin.Aleak zentrifugazio bidez bildu eta 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) eta 20 ng/μl tripsina (Promega, # V5280) dituen 25 mM ABC-ko 200 μl-tan bildu ziren.Tripsinizatu gauean 37 °C-tan biraketaz.Erreakzioa azido formikoa gehituz gelditu zen (Thermo, # A117-50) pH-a 2-3ra iritsi arte.Aleak 3 aldiz garbitu ziren % 0,2 SDS duten PBS 1 mlrekin, 3 aldiz 1 M urea duen PBS 1 mlrekin eta, ondoren, 3 aldiz 1 ml ur destilatuarekin.Eraldatutako peptidoak lisi argiaren bidez (365 nm) askatu ziren 90 minutuz 200 μl% 70 MeOH erabiliz.Zentrifugazioaren ondoren, gainnadantea bildu zen.Aleak behin garbitu ziren 100 μl% 70 MeOH-rekin eta gainnadanteak batu ziren.Laginak Speedvac hutseko kontzentragailu batean lehortu eta -20 °C-tan gorde ziren azterketa arte.
Oxigenoa eraldatutako peptidoak identifikatu eta kuantifikatzeko, laginak % 0,1eko azido formikoan berriro disolbatu ziren eta 1 μg peptido aztertu ziren Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masa-espektrometro batekin hornitutako Tune-ren nano ESI iturri batekin eta Xcalibur-en 4.3.Laginak 75 µm × 15 cm-ko barnean jositako zutabe kapilar batean bereizi ziren 3 µm C18 materialarekin (ReproSil-pur, #r13.b9.) eta EASY-nLC 1200 UHPLC sistema batera konektatu ziren (Thermo).Peptidoak 95 minutuko gradiente kromatografia linealaren bidez bereizi ziren 8% B disolbatzailetik % 50eko B disolbatzailera (A = % 0,1 azido formiko uretan, B = % 0,1 azido formikoa % 80 azetonitriloan), eta gero linealki handitu dira B min % 98ra. 6 minututan 300 nl/min-ko emariarekin.Orbitrap Fusion Lumos-ek datuak biltzen ditu txandaka MS eskaneatu osoa eta MS2 eskaneatzea datuen arabera.Sputtering-tentsioa 2,1 kV-an ezarri zen eta ioi-garraio kapilarren tenperatura 320 °C-koa zen.MS espektroak (350-2000 m/z) 120.000 bereizmenarekin, AGC 4 × 105 eta gehienez 150 ms-ko sarrera-denborarekin bildu ziren.Eskaneaketa osoko biderkadura-kargatutako 10 aitzindari ohikoenak % 30eko talka energia normalizatuarekin, 1,6 m/z-ko koadripoloaren isolamendu-leihoarekin eta 30.000 bereizmen-ezarpenarekin HCD erabiliz zatitu ziren.Tandem masa-espektrometriarako AGC helburu bat 5×104 eta gehienezko sarrera-denbora 150 ms erabiliz.Salbuespen dinamikoa 30 segundotan ezarri da. Esleitu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga zutenak baztertu ziren MS/MSrako. Esleitu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga zutenak baztertu ziren MS/MSrako. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ eta >7+ были отклонены для МС/МС. Esleitu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga duten ioiak baztertu ziren MS/MSrako.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ eta >7+ были отклонены для МС/МС. Zehaztu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga dituzten ioiak baztertu ziren MS/MSrako.
Datu gordinak MSFragger-en oinarritutako FragPipe informatika plataforma erabiliz prozesatzen dira.Masa-alborapenak eta dagozkion aminoazidoak -150 eta 500 Da bitarteko aitzindari masa tolerantzia duen bilaketa-algoritmo ireki baten bidez zehaztu ziren.Ondoren, aldatutako peptidoak identifikatu ziren +229.0964 eta +247.1069 Da-ko masa-irabaziekin histidinaren aldaketak erabiliz PDn (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Fusionatutako miniSOG genea modu egonkorrean adierazten duten zelulak 6 cm-ko plateretan xaflatu ziren.~% 80ko konfluentziara iristean, zelulak behin garbitu ziren HBSSarekin (Gibco, #14025092), ondoren HBSS-n zunda kimikoekin inkubatu ziren ordubetez 37 °C-tan eta argi urdinarekin argiztatu ziren.10W LED 20 minutu giro-tenperaturan.PDPL-n parte hartzen duen oxigeno-espezie erreaktibo motak zehazteko, 0,5 mM C bitamina (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 gehitu zitzaizkien zelulei osagarri gisa.PBS hotzarekin garbitu ondoren, zelulak arraskatu egin ziren, 1,5 ml zentrifugatzaile-hodietan bildu eta 1 minutuz punta batekin sonikatu ziren 200 μl PBS 1x proteasa inhibitzailearekin EDTA gabe (1 s eta 1 s gabe, anplitudea % 35).Ondorioz, nahasketa 15.871 × g-tan zentrifugatu zen 10 minutuz 4 °C-tan eta gainnadantearen kontzentrazioa 1 mg/mL-ra egokitu zen BCA proteina saiatze-kit bat erabiliz.Goiko lisatuaren 50 µl inguru inkubatu ziren 0,1 mM rodamina azidarekin (Aladdin, zk. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandoarekin eta 1 mM CuSO4 ordu 1 giro-tenperaturan behetik gora biratuz.Klik-erreakzioaren ondoren, azetonarekin prezipitazioa egin zen laginei aurrez hoztutako 250 μl azetona gehituz, -20 °C-tan 20 minutuz inkubatuz eta 6010 × g-tan zentrifugatu 10 minutuz 4 °C-tan.Bildu pelleta eta irakiten 1x Laemmli-ren tamponaren 50 µl-tan 10 minutuz 95 °C-tan.Ondoren, laginak SDS-PAGE gel luzeetan aztertu ziren eta Bio-rad ChemiDoc MP Touch irudi-sistema erabiliz bistaratu ziren Image Lab Touch softwarearekin.
MiniSOG-6xHis proteina birkonbinatuaren adierazpena eta arazketa aurretik deskribatu bezala egin zen.Laburbilduz, E. coli BL21 (DE3) zelulak (TransGen, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis-ekin eraldatu ziren eta proteinaren adierazpena 0,5 mM IPTGrekin (Sangon, # A600168) eragin zuten.Zelulen lisiaren ondoren, proteinak Ni-NTA agarosa aleak erabiliz (MCE, 70666 zk.), PBSren aurka dializatu eta –80 °C-tan gorde ziren.
Antigorputzetan oinarritutako in vitro etiketa hurbileko saiakuntza baterako, nahastu 100 μM araztutako miniSOG, 1 mM zunda 3 eta 1 μg etiketa kontrako saguaren antigorputz monoklonal (TransGen, #HT501-01) PBSn 50 μl-ko erreakzio-bolumen guztira..Erreakzio-nahasketa LED argi urdinarekin irradiatu zen 0, 2, 5, 10 eta 20 minutuz giro-tenperaturan.Nahasketa 0,1 mM biotina-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligandoarekin eta 1 mM CuSO4-rekin inkubatu zen ordubetez giro-tenperaturan goranzko mugimendu-astingailu batean.Erreakzio labur baten ondoren, gehitu 4x Laemmli-ren buffer zuzenean nahasketara eta irakiten 95 ° C-tan 10 minutuz.Laginak SDS-PAGE geletan aztertu ziren eta western blot bidez aztertu ziren estreptavidin-HRPrekin (1:1000, Solarbio, #SE068).
C-terminal amidazioa duen histidina duen peptido sintetikoa (LHDALDAK-CONH2) hurbileko peptidoetan oinarritutako in vitro etiketaketa aztertzeko erabili zen.Entsegu honetan, 100 μM araztutako miniSOG, 10 mM zunda 3 eta 2 μg/ml peptido sintetikoa PBSn nahastu ziren 50 μl-ko erreakzio-bolumen guztira.Erreakzio-nahasketa LED argi urdinarekin irradiatu zen ordubetez giro-tenperaturan.Laginaren mikrolitro bat LC-MS sistema baten bidez aztertu zen (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight masa-espektrometroa MassLynx espektroaren analisi softwarearekin).
MiniSOG fusio genea modu egonkorrean adierazten duten HEK293T zelulak 10 cm-ko plateretan hazi ziren organulu lokalizazio desberdina zuten lerroetarako (Mito, ER, Nucleus) eta 15 cm-ko plateretan Parkin-miniSOG eta BRD4-miniSOG lerroetarako.~% 90eko konfluentziara iristean, zelulak behin garbitu ziren HBSSarekin, ondoren 3. zunda HBSS-n inkubatu ziren ordubetez 37 °C-tan eta 10 W-ko LED urdin batekin argiztatu ziren giro-tenperaturan.Parkin-en ukipenik gabeko etiketa egiteko, 10 µM protoi karbonilo zianuro garraiatzailea CCCP (Solarbio, #C6700) 3. zunda HBSSn gehitu zen ordubetez 37 °C-tan.Zelulen lisi, klik-kimika, murrizketa eta alkilazio-urratsak goian deskribatutako berdinak izan ziren, salbu eta 2 mg lisatu gehitu ziren eta biotina PEG3 azida erabili zen klik erreakzioan biotina azida fotodegradagarria izan beharrean.Aberastu ondoren, aleak 3 aldiz garbitu ziren % 0,2 SDS duten 5 ml PBSrekin, 3 aldiz 1 M urea duten PBS 5 mlrekin eta 3 aldiz 5 ml PBSrekin.Ondoren, 2 µg tripsina gehitu zitzaizkion 1 M urea zuen 300 µl 25 mM ABCri proteina gauean 37 °C-tan mozteko.Erreakzioa azido formikoa gehituz gelditu zen 2-3 pH-ra iritsi arte.Aleetan tripsinizatu ondoren, peptido-soluzioa gatzgabetu zen SOLAµ HRP zutabe batekin (Thermo, #60209-001) eta lehortu zen Speedvac hutseko kontzentragailu batean.Peptidoak %0,1eko azido formikoan berriro disolbatu ziren eta 500 ng peptido aztertu ziren goian deskribatutako nano-ESI iturriaz hornitutako Orbitrap Fusion Lumos Tribrid masa-espektrometroa erabiliz.Peptidoak RP-HPLC aurrezutabe komertzialetan (75 μm x 2 cm) (Thermo, 164946 zk.) eta RP-HPLC zutabe analitikoetan (75 μm x 25 cm) (Thermo, 164941 zk.) bereizi ziren, biak 2 μm-z beteta.gradientea % 8tik % 35era ACN 60 minututan, gero linealki B % 98ra igo zen 6 minututan 300 Nl/min-ko emariarekin.MS espektroak (350-1500 m/z) 60.000 bereizmenarekin, AGC 4 × 105 eta gehienez 50 ms-ko sarrera-denborarekin bildu ziren.Hautatutako ioiak sekuentzialki zatitu ziren 3 s-ko zikloetan HCD-k % 30eko talka-energia normalizatuarekin, 1,6 m/z-ko koadripoloaren isolamendu-leihoarekin eta 15000ko bereizmenarekin. 5 × 104 tandem masa espektrometroko AGC helburua eta injekzio denbora maximoarekin 22 ms erabili ziren.Bazterketa dinamikoa 45 segundotan ezartzen da. Esleitu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga zutenak baztertu ziren MS/MSrako. Esleitu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga zutenak baztertu ziren MS/MSrako. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ eta >7+ были отклонены для МС/МС. Esleitu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga duten ioiak baztertu ziren MS/MSrako.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ eta >7+ были отклонены для МС/МС. Zehaztu gabeko ioiak edo 1+ eta >7+ karga dituzten ioiak baztertu ziren MS/MSrako.
NeutrAvidin aleak aberasteko laginak prestatzeko urratsak goian deskribatutako LC-MS/MS analisiaren berdinak izan ziren.Gutxi gorabehera 50 μg lisato erabili ziren karga-kontrolerako sarrera gisa eta 2 mg lisato erabili ziren klik erreakzioetarako.Neutrabidinarekin aberastu eta garbitu ondoren, loturiko proteinak agarosa erretxina aleei Laemmli-ren buffer 50 μl gehituz eta 5 minutuz 95° C-tan irakiten utzi ziren.Kontrol-karga-sarrera eta aleak aberastutako laginak SDS-PAGE bidez aztertu eta PVDF mintzetara (Millipore, #ISEQ00010) transferitu ziren Western blot metodo estandarren bidez.Mintzak % 5eko esne gaingabetuarekin (Sangon, # A600669) blokeatu ziren % 0,1eko tween-20 (TBST) zuen TBS-n eta sekuentzialki inkubatu ziren lehen eta bigarren mailako antigorputzekin.Antigorputzak 1:1000% 5eko esne gaingabetuan diluitu ziren TBSTn eta gau osoan inkubatu ziren 4 °C-tan.Bigarren mailako antigorputzak 1:5000 proportzioan erabili ziren eta ordubetez inkubatu ziren giro-tenperaturan.Mintzak kimilumineszentziaz bistaratu ziren Chemidoc MP irudi sistema erabiliz.Irudiko blots eta gelen eskaneatu gabe guztiak datu gordina gisa aurkezten dira.
Ikerketa honetan erabilitako lehen antigorputzek untxiaren aurkako SFPQ antigorputz monoklonala (CST, 71992 zk.), untxiaren aurkako FUS antigorputz monoklonala (CST, 67840 zk.), untxiaren aurkako NSUN2 antigorputz poliklonala (Proteintech, 20854-1- zk.). AP), untxiaren anti-mSin3A antigorputz poliklonala (Abcam, #ab3479), saguaren etiketaren aurkako antigorputz monoklonala (TransGen, #HT201-02), saguaren aurkako β-actin antigorputz monoklonala (TransGen, #HC201-01), untxiaren aurkako antigorputz -CDK2 antigorputz monoklonala (ABclonal, #A0094), untxiaren antigorputz monoklonala CTBP1 (ABclonal, #A11600), untxiaren antigorputz poliklonala DUT (ABclonal, #A2901), untxiaren antigorputz poliklonala PSMC4 (ABclonal, #A2505), untxiaren anti- DNAJB1 antigorputz poliklonala (ABclonal, # A5504).Antigorputz hauek 1:1000 diluzioan erabili ziren %5eko esne gaingabetuan TBSTn.Ikerketa honetan erabilitako bigarren mailako antigorputzak untxiaren aurkako IgG (TransGen, # HS101-01), saguaren aurkako IgG (TransGen, # HS201-01) 1:5000 diluzioan zeuden.
BRD4 SFPQrekin elkarreragiten duen ala ez ikertzeko, HEK293T gainespresatzen duten HEK293T eta BRD4-miniSOG zelula egonkorrak 10 cm-ko plateretan xaflatu ziren.Zelulak PBS hotzarekin garbitu eta 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, # 87787) EDTArik gabeko proteasa inhibitzailearekin lisatu ziren 30 minutuz 4 ° C-tan.Horren ostean, lisadoak 1,5 ml-ko zentrifuga-hodietan bildu eta 15.871 xg-tan zentrifugatu ziren 10 minutuz 4 °C-tan.Gain-nadantea bildu eta inkubatu zen V5-ren aurkako saguaren antigorputz monoklonalaren (CST, #80076) 5 µg-rekin inkubatu zen gau osoan 4 °C-tan.Garbitu gutxi gorabehera 50 µl proteina A/G ale magnetiko (MCE, #HY-K0202) bi aldiz % 0,5 Tween-20 duen PBSarekin.Ondoren, zelulen lisadoak ale magnetikoekin inkubatu ziren 4 orduz 4 °C-tan, behetik gora biratuz.Ondoren, aleak lau aldiz garbitu ziren 1 ml PBST tamponarekin eta 95 ° C-tan irakiten 5 minutuz.Laginak SDS-PAGE geletan aztertu eta PVDF mintzetara transferitu ziren Western blot metodo estandarrak erabiliz.Mintzak % 5eko esne gaingabetuan blokeatu ziren TBSTn eta sekuentzialki inkubatu ziren lehen eta bigarren mailako antigorputzekin.Primary Antibody Rabbit anti-SFPQ antigorputz monoklonal (CST, #71992) 1:1000 proportzioan erabili zen TBSTn %5eko esne gaingabetuan eta gauean inkubatu zen 4°C-tan.Untxiaren aurkako IgG 1:5000 proportzioan erabili zen eta ordubetez inkubatu zen giro-tenperaturan.Mintzak kimilumineszentziaz bistaratu ziren Chemidoc MP irudi sistema erabiliz.
Solvent Accessible Surface Area (SASA) analisirako erabilitako egitura guztiak Protein Data Bank (PDB)52 edo AlphaFold Protein Structure Databasetik53 lortu dira.Hondakin bakoitzeko SASA absolutua kalkulatu da FreeSASA programa erabiliz.Etiketatutako histidina eta bere inguruko SASA datu osoak eta anbiguoak soilik erabili dira egitura bakoitzaren batez besteko SASA lortzeko.Histidina bakoitzeko disolbatzaileen irisgarritasun erlatiboa (RSA) kalkulatu da SASA balio absolutua disolbatzaileak eskura dezakeen hondakinen azalera maximo enpirikoarekin zatituz.Orduan, histidina guztiak ezkutuan sailkatu ziren batez besteko RSA %20tik beherakoa bazen, bestela agerian56.
DDA moduan lortutako fitxategi gordinak Proteome Discoverer (v2.5) edo MSfragger (Fragpipe v15.0) erabiliz bilatu ziren kutsatzaile arruntak dituen SwissProt egiaztatutako proteina datu-base egokian.Peptidoek tripsina osoa behar zuten bi zatiketa gune falta ziren, carbamoil metilazioa aldaketa finko gisa eta metionina oxidazioa aldaketa dinamiko gisa.Aitzindari eta zatien pisuaren tolerantzia 10 ppm eta 0,02 Da (MS2 Orbitrap) ezarri ziren, hurrenez hurren. Kutsatzaileen kolpeak kendu ziren, eta proteinak iragazi ziren aurkikuntza-tasa faltsu bat lortzeko %1ekoa. Kutsatzaileen kolpeak kendu ziren, eta proteinak iragazi ziren aurkikuntza-tasa faltsu bat lortzeko %1ekoa. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полунко% 1% полунфчо были удалены. Kutsatzaileen kolpeak kendu eta proteinak iragazi ziren, faltsu detekzio-tasa <1% izateko.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены 1. Kutsatzaileen kolpeak kendu eta proteinak iragazi ziren positibo faltsu-tasa <1% lortzeko.Etiketak erabili gabe analisi kuantitatiboa egiteko, hiru errepikapen biologikoetako proteina eduki normalizatua erabili zen.Proteinen lokalizazio azpizelularraren azterketa DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 eta Alice Ting taldeak bildu eta argitaratutako datu-baseen Gene Ontology (GO) analisia erabiliz egin da.Sumendien mapa Perseotik lortu zen (v1.6.15.0). Proteinen ugaritasunaren tolesdura-aldaketak esanahi estatistikorako probatu ziren bi aldeetako t-test baten bidez, eta proteinaren arrakastak ugaritasun-aldaketa > 2 (besterik adierazi ezean) eta p balioarekin identifikatu ziren. Proteinen ugaritasunaren tolesdura-aldaketak esanahi estatistikorako probatu ziren bi aldeetako t-test baten bidez, eta proteinaren arrakastak ugaritasun-aldaketa > 2 (besterik adierazi ezean) eta p balioarekin identifikatu ziren. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Protein-edukiaren tolestura-aldaketak esanahi estatistikorako probatu ziren bi isatseko t-test baten bidez, eta proteina-partidak eduki-aldaketa > 2 (besterik adierazi ezean) eta ap balio <0,05 batekin identifikatu ziren.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 的 丰度丰度 变化> 2 (除非 另 有 说明) 和 P 值 <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 中 的 丰度 变化 蛋白质 命 的 丰度 变化 变化 变化 变化 丰度 变化 变化 变化 命 的 丰度 变化 变化 命 的 丰度 变化 变化 变化 命 的 丰度 变化 变化 的 命 的 丰度 变化 变化 的 命 的 丰度 变化 变化 的 测试 的 丰度 变化 变化 的 的 测试 丰度 变化 变化 变化 的 测试 的 丰度 变化 变化 的 测试 的 变化 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Proteina-edukiaren tolestura-aldaketen esangura estatistikoa bi isatseko t-test baten bidez probatu zen, eta proteina-partaidetzak zehaztu ziren eduki-aldaketetarako > 2 (besterik adierazi ezean) eta p-balioetarako <0,05.Proteinen interakzioaren analisia GO analisia erabiliz egin da String datu-basearekin batera.
Hiru erreplika biologiko egin ziren antzeko emaitzekin.Analisi estatistikoa GraphPad Prism-ekin (GraphPad softwarea) egin zen eta Perseus-ekin sumendien grafikoak sortu ziren (v1.6.15.0).Bi taldeak alderatzeko, p-balioak zehaztu ziren bi isatseko Student-en t-testa erabiliz.Talde esperimentalean gutxienez bi aldiz identifikatutako proteina bakarrekoak bakarrik sartu ziren sumendien grafikoetan, eta kontrol taldean falta ziren balioak Perseus-ekin ordezkatu ziren banaketa normal batetik, p-balioa kalkulatu ahal izateko.Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.Analisi estatistikorako analisi proteomikoetan, gutxienez bi erreplika biologikotan agertu ziren proteinen ugaritasuna mantendu zen.Metodo estatistikoak ez ziren erabili laginaren tamaina aldez aurretik zehazteko.Esperimentuak ez dira ausazkoak.Ikertzaileak ez ziren itsu egin esperimentuan eta emaitzen ebaluazioan egin beharreko zereginei.
Ikerketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikusi artikulu honi lotutako Nature Research Report laburpena.
Ikerketa honetan lortutako masa-espektrometriako datuak ProteomeXchange Partzuergora bidali ziren iProX57 bazkideen biltegiaren bidez, PXD034811 datu-multzoaren IDarekin (PDPL-MS datu-multzoa).Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.Artikulu honek jatorrizko datuak ematen ditu.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Auzoa ezagutzea: hurbiltasunaren menpeko biotinilazioa erabiltzea proteina-konplexuak karakterizatzeko eta organuluak mapatzeko. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Auzoa ezagutzea: hurbiltasunaren menpeko biotinilazioa erabiltzea proteina-konplexuak karakterizatzeko eta organuluak mapatzeko.Gingras, AS, Abe, KT eta Raut, B. Inguruarekin ezagutzea: hurbiltasunaren menpeko biotinilazioa erabiltzea proteina-konplexuak karakterizatzeko eta organuluak mapatzeko. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Auzoa ulertzea: auzoak bizitza biologikoarekiko duen menpekotasuna erabili.Gingras, AS, Abe, KT eta Raut, B. Hurbiltasuna ulertzea: proteina-konplexuen karakterizazioa eta organuluen mapaketa hurbiltasunaren menpeko biotinilazioa erabiliz.Oraingoa.Nire iritzia.Kimikoa.biologia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mikroingurunea mapatzea Dexter energia zelula immuneetara transferituz.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Bi proteomaren eskala sareek giza interaktomaren zelulen berariazko birmoldaketa detektatzen dute.184. gelaxkak, 3022–3040.e3028 (2021).