Berriak

Gaixotasun infekziosoak detektatzeko diagnostiko-estrategi tradizionalek arreta puntuko probak egiteko (POCT) egokiak ez diren mahai gaineko tresnak erabiltzea eskatzen dute.Sortzen ari den mikrofluidika oso miniaturizatua, automatizatua eta integratua den teknologia bat da, metodo tradizionalen alternatiba potentziala den tokian tokiko diagnostiko azkarrak, merkeak eta zehatzak egiteko.Diagnostiko molekularreko metodoak asko erabiltzen dira gailu mikrofluidikoetan, patogenoak detektatzeko metodo eraginkorrenak direlako.Berrikuspen honek gaixotasun infekziosoen mikrofluidikoan oinarritutako diagnostiko molekularrean egindako azken aurrerapenak laburbiltzen ditu, bai ikuspegi akademikotik bai industriatik.Lehenik eta behin, azido nukleikoen txip-en prozesamendu tipikoa deskribatzen dugu, laginaren aurretratamendua, anplifikazioa eta seinalearen irakurketa barne.Ondoren, lau plataforma mikrofluidikoen ezaugarriak, abantailak eta desabantailak alderatzen dira.Jarraian, azido nukleikoen kuantifikazio absoluturako saiakuntza digitalen erabilera eztabaidatuko dugu.Mikrofluidikoetan oinarritutako diagnostiko molekularreko gailu klasikoak eta berrienak merkatuaren egungo egoeraren froga gisa laburbiltzen dira.Azkenik, gaixotasun infekziosoen diagnostiko mikrofluidikoaren etorkizuneko norabideak proposatzen ditugu.
Gaixotasun infekziosoak mundu osoan banatuta dauden bakterio, birus eta parasitoek eragiten dituzte.Beste gaixotasun batzuek ez bezala, patogenoak azkar kutsatzen dira eta gizakien eta animalia ostalarien artean hedatzen dira inokulazio, aire eta ur medioen bidez [1].Gaixotasun infekziosoak prebenitzea funtsezkoa da osasun publikoko neurri gisa.Gaixotasun infekziosoei aurre egiteko hiru estrategia nagusi: (1) infekzio-iturria kontrolatzea;(2) transmisio-bidea etetea;(3) populazio jasangarrien babesa.Estrategia nagusien artean, infekzio-iturriaren kontrola estrategia garrantzitsuena da bere erosotasunagatik eta kostu baxuagatik.Infektatutako pertsonen diagnostiko azkarra, isolamendua eta tratamendua funtsezkoak dira, diagnostiko estrategia azkarrak, sentikorrak eta zehatzak behar dituzte [2].Gaixotasun infekziosoen egungo diagnostikoak, normalean, zeinu eta sintometan oinarritutako azterketa klinikoa eta laborategiko azterketak konbinatzen ditu, hala nola zelula-kultura eta diagnostiko molekularra, zeinak langile trebatuak, eskulan intentsiboko prozedurak eta saiakuntza-ekipamendu garestiak behar ditu [3, 4].Gaixotasun infekziosoen agerraldiak prebenitzeak tokiko diagnostiko azkarra, merke eta zehatza eskatzen du, batez ere baliabideak mugatutako eremuetan, gaixotasun infekziosoak ohikoak eta larriak diren [5], baita basamortuan edo gudu-zelaian tratamendua ere, non larrialdiak ezustekoak diren..arreta medikoa mugatua da [6].Testuinguru honetan, mikrofluidika sistema mikroelektromekanikoen teknologiak, nanoteknologia edo materialen zientzia konbinatzen dituen teknologia da fluidoen manipulazio zehatza lortzeko [7,8,9,10], arreta puntuan detektatzeko (POCT) aukera berriak eskainiz.) ospitale eta laborategietatik kanpoko agente infekziosoak.Denbora asko behar duten diagnostiko tradizionalekin alderatuta, teknologia mikrofluidikoak laginak eta kostuak aurrezten ditu gaixotasunen agerraldietan diagnostiko molekularretarako.2019 (COVID-19) koronavirus gaixotasunaren hedapen globala koronavirus 2 (SARS-CoV-2) arnas sindrome akutu larriak eragiten du, beraz, berriro azpimarratzen da mikrofluidikaren garrantzia pandemia garaiz prebenitzeko eta kontrolatzeko [11, 12]. , 13].Diagnostiko tradizionalak ez bezala, POCT mikrofluidikoak gailu eramangarri txikiak erabiltzen ditu laginketa-puntutik gertu probatzeko, mahaiko analizagailuetatik hasi eta alboko proba-banda txikietaraino [14].Proba hauek lagin-prestaketa sinplista edo ez dute, seinalearen anplifikazio azkarra eta seinale-irakurketa sentikorrak eskaintzen dituzte, iraupen laburra eta emaitza zehatzak minutu gutxiren buruan.Mikrofluidikoetan oinarritutako osasun-tresnen erabilgarritasunak eta ekoizpen masiboek beren diagnostiko-aplikazio errentagarriak eta zuzenak zabaldu dituzte ospitaletik kanpo, gaixoaren ondoan eta baita etxean ere.
Gaixotasun infekziosoak diagnostikatzeko dauden estrategien artean, diagnostiko molekularra sentikorrenetako bat da [15, 16].Horrez gain, diagnostiko molekularra sarritan erabiltzen da COVID-19 etengabe detektatzeko urrezko estandar gisa, birusen ARN edo DNAren eskualde espezifikoak zuzenean detektatzeko aukera ematen baitu erantzun immunologikoa hasi aurretik [17, 18].Oraingo berrikuspenean, gaixotasun infekziosoetarako mikrofluidikan oinarritutako diagnostiko molekularreko prozesuetan egindako azken aurrerapenak aurkezten ditugu, ikuspegi akademikotik etorkizuneko ikuspegi industrialetara (1. irudia).Azido nukleikoa detektatzeko hiru pauso gakorekin hasiko gara: txiparen laginaren aurretratamendua, azido nukleikoen anplifikazioa eta seinalearen irakurketa.Ondoren, plataforma mikrofluidiko mota desberdinak euren egitura eta funtzioarekin alderatu ditugu, ezaugarri bereziak erakutsiz (indarguneak eta ahuleziak).Azido nukleikoen detekzio digitala gehiago eztabaidatzen da eta hirugarren belaunaldiko teknologia baten adibide gisa ematen da patogeno infekziosoen molekula absolutuak kuantifikatzeko.Horrez gain, diagnostiko molekularretarako POCT mikrofluidikoaren merkatuaren egungo egoera erakusteko hainbat POCT gailu tipiko eta berrienak aurkeztuko dira.Etorkizuneko aplikazioetarako dugun ikuspegia ere eztabaidatu eta azalduko dugu.
Azido nukleikoak detektatzeko txip mikrofluidikoen moduluak hiru kategoriatan bana daitezke (laginketa, ezagutzea eta seinaleztapena) haien funtzioen arabera [19].Modulu horien artean, laginketa-modulua batez ere laginaren lisiaz eta azido nukleikoen erauzketa egiten da.Sentsore moduluak batez ere azido nukleikoen seinaleen bihurketa eta anplifikazioa kontrolatzen ditu.Seinale-moduluak sentsore-moduluak bihurtutako eta prozesatutako seinalea detektatzen du.Txip batean azido nukleikoak detektatzeko prozesuan oinarrituta, "sarrera eta irteera" funtzioa gauza dezaketen txip ezberdinak laburbilduko ditugu.
Azido nukleikoa detektatzeko lehen urratsa azido nukleikoa erauztea da, hau da, xede azido nukleikoa jatorrizko lagintik isolatzea.Azido nukleikoen erauzketa beste kutsatzaile molekularretatik azido nukleikoak arazteko egiten da, azido nukleikoen molekulen egitura primarioaren osotasuna bermatzeko eta emaitzak optimizatzeko.Azido nukleikoen erauzketa beharrezkoak diren laginaren lisiak eta azido nukleikoak harrapatzea eskatzen du, eta horien kalitateak eta eraginkortasunak eragin handia dute ikerketa eta diagnostiko emaitzetan.Erauzketan zehar edozein bigarren mailako efektu sotil detekzio gehiago mugatu daiteke.Esate baterako, polimerasaren kate-erreakzioa (PCR) eta begizta isotermiko anplifikazioa (LAMP) metodoak hondar disolbatzaile organiko batzuek inhibitzen dituzte, hala nola, etanola eta isopropanola azido nukleikoen isolamendu erreaktiboetan [20].Likido-likidoaren erauzketa eta fase solidoko erauzketa dira azido nukleikoak isolatzeko metodo ezagunenak [21], hala ere, txip batean likido-likidoaren erauzketa oso mugatua da, likido-likidoaren erauzketan erabiltzen diren erreaktiboek txip mikrofluidiko gehienen korrosioa eragiten baitute. .Hemen, mikroarrayetan oinarritutako fase solidoko erauzketa metodoak nabarmentzen ditugu eta haien abantailak eta desabantailak alderatzen ditugu.
Silizioa azido nukleikoekin bateragarria den substratu-materiala da, bere biobateragarritasunagatik, egonkortasunagatik eta aldatzeko erraztasunagatik [22].Garrantzitsua denez, silizearekin edo beste material batzuekin aldatzen denean, konposatu honek karga negatiboko azido nukleikoak xurgatzeko propietateak ditu pH baxuan, gatz altuko baldintzetan, pH altu eta gatz baxuko soluzioekin elutzen den bitartean.Fenomeno horretan oinarrituta, posible da azido nukleikoa arazteko.
Silice-oinarritutako materialen forma desberdinak erabili dira mikrofluidikan azido nukleikoak erauzteko, hala nola silize aleak, hautsak, mikrozuntz iragazkiak eta silize-mintzak [23, 24, 25, 26].Materialaren propietateen arabera, silizioan oinarritutako materialak modu ezberdinetan erabil daitezke mikrozirkuituetan.Esate baterako, silize pikor, hauts eta nanoiragazki komertzialak txip mikrofluidikoen poroetan edo mikrokanaletan jar daitezke eta laginetatik azido nukleikoak ateratzen laguntzen dute [27, 28, 29].Azalera eraldatutako silize-mintzak ere erabil daitezke DNA patogenoetatik azkar arazteko, kostu txikian.Adibidez, Wang et al.[30] Desnaturalizazio-anplifikazio-erreakzioak besikulen bidezko kate-trukearekin kitosano-oligosakaridoz estalitako silize-mintzekin konbinatuz, sistema eramangarri polifazetikoa sartu zen, 102-108 koloniak eratzeko unitate arrakastatsu detektatu zituena.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., eta birusaren presentzia erraz ikusten zen.Powell et al.[31] Silizioan oinarritutako mikroarrayak erabili ziren orduan C hepatitisaren birusa (HCV), giza immunoeskasiaren birusa (GIB), Zika birusa eta giza papilomabirusa eta hedapen automatikoa detektatzeko, zeinetan 1,3 μl-ko mikroerreaktore bihurgunetsu bat garatu zen RNA birusak harrapatzeko.eta in situ anplifikazioa egin.Metodo horiez gain, gainazalean eraldatutako silize mikrozutabeek ere funtsezko zeregina dute azido nukleikoen erauzketan, material aldatzailearen geometriak eta propietateek erauzketa eraginkortasuna asko handitzen baitute.Chen et al.[32]-k kontzentrazio baxuko RNA isolatzeko plataforma mikrofluidiko bat proposatu zuen aminoz estalitako siliziozko mikrozutabeetan oinarrituta.Gailu mikrofluidiko honek 0,25 cm2-ko mikropilare sorta bat integratzen du siliziozko substratu batean, erauzketa eraginkortasun handiagoa lortzeko azalera handiko bolumen erlazioaren diseinuaren bidez.Diseinu honen abantaila da gailu mikrofluidikoak azido nukleikoen erauzketa-eraginkortasuna %95era arte lor dezakeela.Silizioan oinarritutako estrategia hauek kostu baxuan azido nukleikoak azkar isolatzearen balioa erakusten dute.Txip mikrofluidikoekin konbinatuta, silizioan oinarritutako erauzketa estrategiek azido nukleikoaren detekzioaren eraginkortasuna areagotzeaz gain, gailu analitikoen miniaturizazioa eta integrazioa erraztu dezakete [20].
Bereizketa magnetikoko metodoek partikula magnetikoak erabiltzen dituzte azido nukleikoak isolatzeko kanpoko eremu magnetiko baten aurrean.Gehien erabiltzen diren partikula magnetikoak silize, amino eta karboxiloz estalitako Fe3O4 edo γ-Fe2O3 partikula magnetikoak dira [33,34,35,36].Partikula magnetikoen ezaugarri bereizgarria silizioan oinarritutako SPE metodoekin alderatuta, kanpoko imanekin manipulatzeko eta kontrolatzeko erraztasuna da.
Azido nukleikoen eta silizearen arteko interakzio elektrostatikoa erabiliz, gatz handiko eta pH baxuko baldintzetan, azido nukleikoak silizez estalitako partikula magnetikoen gainazalean xurgatzen dira, gatz baxuko eta pH handiko baldintzetan, berriz, molekulak garbitu daitezke. berriz..Silizez estalitako ale magnetikoek bolumen handiko laginetatik (400 μL) DNA ateratzeko aukera ematen dute magnetikoki kontrolatutako mugimendua erabiliz [37].Erakusgarri gisa, Rodriguez-Mateos et al.[38] iman sintonizagarriak erabili zituzten ale magnetikoen transferentzia ganbera ezberdinetara kontrolatzeko.Silicez estalitako partikula magnetikoetan oinarrituta, SARS-CoV-2 RNA genomikoaren 470 kopia/mL atera daitezke hondakin-ur laginetatik LAMP alderantzizko transkripzioa detektatzeko (RT-LAMP) eta erantzuna ordubeteko epean irakur daiteke.begi hutsez (2a. irud.).
Material magnetiko eta porotsuetan oinarritutako gailuak.SARS-CoV-2 RNA detektatzeko IFAST RT-LAMP gailu mikrofluidikoaren kontzeptu-diagrama ([38]tik egokitua).b Mikro-gailu zentrifugorako azido nukleikoko zigiluaren dSPErako ([39]tik egokitua).c Lagin-kontzentragailu autoalimentatua integratua, FTA® txartela erabiliz ([50]tik egokitua).d Fusion 5 iragazki-papera kitosanoarekin aldatua ([51]tik egokitua).SARS-CoV-2 arnas sindrome akutu larria koronavirus 2, RT-LAMP alderantzizko transkripzioaren begizta bidezko anplifikazio isotermikoa, FTA aurkitzaileak teknologia-bazkideak, NA azido nukleikoa
Positiboki kargatutako partikula magnetikoak aproposak dira azido nukleiko baten fosfatoaren bizkarrezurra lotzeko.Gatz-kontzentrazio jakin batean, negatiboki kargatutako fosfato-taldeak positiboki kargatu daitezke partikula konposatu magnetikoen gainazalean.Hori dela eta, gainazal latza eta amino-taldeen dentsitate handiko nanopartikula magnetikoak garatu ziren azido nukleikoak erauzteko.Bereizketa eta blokeo magnetikoaren ondoren, nanopartikula magnetikoak eta DNA konplexuak zuzenean erabil daitezke PCRan, eta horrek garbiketa eta eluzio eragiketa konplexuak eta denbora asko behar dituztenak ezabatzen ditu [35].Karboxilo talde negatiboz estalitako nanopartikula magnetikoak ere erabili izan dira gainazaletan xurgatutako azido nukleikoak bereizteko kontzentrazio handiko polietilenglikol eta sodio kloruro disoluzioetan [36].Azalera eraldatutako ale magnetiko hauekin, DNAren erauzketa bateragarria da ondorengo anplifikazioarekin.Dignan et al.[39] azido nukleikoen aurretratamendurako plataforma zentrifugo mikrofluidiko automatizatu eta eramangarri bat deskribatu zuen, teknikari ez diren langileei tokian bertan erabiltzeko aukera emanez.Horrez gain, isolatutako DNAren bateragarritasunak LAMParekin, arreta puntuko azido nukleikoen analisirako oso egokia den metodoa, ekipamendu eskakizun minimoak eta saiakuntza kolorimetrikoetarako egokitasuna erakusten du (2b. irudia).
Ale magnetikoen metodoek erauzketa automatizatua egiteko aukera eskaintzen dute, horietako batzuk azido nukleikoen erauzgailu automatizatu komertzialetan [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, AEB), QIAcube® HT;CapitalBio (Pekin, Txina) eta Biomek®;Beckman (Miami, AEB).), Florida, AEB).Ale magnetikoak mikrofluidikarekin konbinatzearen abantailak azido nukleikoen erauzketa automatizatu eraginkorra lortzeko erabil daitezke, eta horrek diagnostiko molekularren garapenean aurrera egin dezake;hala ere, ale magnetikoak mikrofluidikarekin konbinatzea oraindik ere asko oinarritzen da ale magnetikoen manipulazio zehatzerako kontrol-sistema konplexuetan, eta horrek azaltzen du produktu komertzialen ospea handiak eta garestiak izatea, eta horrek POCT-en ale magnetikoak gehiago aplikatzea mugatzen du.
Hainbat material porotsu, hala nola, nitrozelulosa eraldatutako iragazkiak, Finders Technology Associates (FTA) txartelak, polietersulfonan oinarritutako iragazki-paperak eta glikanoz estalitako materialak ere erabili dira azido nukleikoak detektatzeko [40, 41, 42, 43, 44].Zuntz-papera bezalako zuntz-material porotsuak DNA isolatzeko erabili ziren lehen aldiz kate luzeko DNA molekulak zuntzekin korapilatuz.Poro txikiek DNA molekulen murrizketa fisiko handia eragiten dute, eta horrek positiboki eragiten du DNAren erauzketa.Zuntzezko paperaren poro-tamaina desberdinak direla eta, erauzketa-eraginkortasunak ezin ditu DNA anplifikazioaren beharrak asetu [45, 46].FTA txartela auzitegi-medikuntzaren alorrean erabiltzen den iragazki paper komertziala da eta diagnostiko molekularraren beste arlo batzuetan oso erabilia da.Laginaren zelulen mintzak lisatzeko hainbat produktu kimikoz bustitako zelulosa-iragazki-papera erabiliz, askatzen den DNA degradaziotik babesten da 2 urtez.Duela gutxi, inpregnatutako zelulosa-papera hainbat patogeno molekularra detektatzeko garatu da, besteak beste, SARS-CoV-2, leishmaniasia eta malaria [47,48,49].Isolatutako plasmako GIBa zuzenean lisatzen da, eta azido nukleiko birikoa kontzentratzailean integratutako FTA® fluxuaren mintzean aberasten da, eta horrek azido nukleikoaren ekoizpen eraginkorra ahalbidetzen du [50] (2c. irudia).FTA txartelak erabiliz azido nukleikoak detektatzeko arazo nagusia da guanidina eta isopropanola bezalako produktu kimikoek ondorengo anplifikazio erreakzioak inhibitzen dituztela.Arazo hau konpontzeko, Fusion 5 kitosanoz eraldatutako iragazki-papera garatu dugu, zeinak DNA molekulen eta zuntz-iragazki-paperen arteko elkarlatze fisikoaren abantailak eta kitosanoak eraldatutako konposatuetan DNAren adsortzio elektrostatikoa konbinatzen dituen azido nukleikoen erauzketa oso eraginkorra lortzeko. ..iragazki-zuntzak [51] (2d. irudia).Era berean, Zhu et al.[52] zika birusaren RNA azkar isolatzeko eta detektatzeko in situ kapilar mikrofluidiko sistema batean oinarritutako kitosanoz eraldatutako PCR metodo bat frogatu zuten.Azido nukleikoak lisatu/PCR medio misto batean xurgatu/desorbitu daitezke, hurrenez hurren, kitosanoaren etengailuaren etengailuan oinarrituta.piztu eta itzali”, pH-ari erantzuteko.
Arestian esan bezala, estrategia hauek fase solidoko materialen abantailak konbinatzen dituzte eta azido nukleikoaren erauzketa eraginkortasuna areagotzen dute mikrofluidikan.Aplikazio praktikoetan, material hauek kantitate handietan erabiltzea ez da ekonomikoa, eta material horiekin ohiko materialen gainazaleko tratamendu egokiak edo gainazaleko aldaketak ere beren funtzioa gorde dezakete.Hori dela eta, azterketa pilotu baten ondoren estrategia hauek ezartzeak kostuak murriztu ditzakeela uste da.
Plataforma mikrofluidikoetan azido nukleikoen probak sarritan lagin-bolumen txikiak erabiltzen ditu (< 100 µl), beraz, helburuko azido nukleikoen anplifikazioa behar da zunda espezifikoekin, beheran detektatzeko egokia den seinale batera bihurtzeko (optikoa, elektrikoa eta magnetikoa) [53, 54]. Plataforma mikrofluidikoetan azido nukleikoen probak sarritan lagin-bolumen txikiak erabiltzen ditu (< 100 µl), beraz, helburuko azido nukleikoen anplifikazioa behar da zunda espezifikoekin, beheran detektatzeko egokia den seinale batera bihurtzeko (optikoa, elektrikoa eta magnetikoa) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Azido nukleikoak plataforma mikrofluidikoetan probatzen direnean, lagin-bolumen txikiak (<100 µL) erabiltzen dira sarri, beraz, xede-azido nukleikoen anplifikazioa zunda bereziekin beharrezkoa da gero detektatzeko seinale egokia bihurtzeko (optikoa, elektrikoa eta magnetikoa). [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 (<100 μl), 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸, 以 为 便于 下游 检测 检测 检测 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 下游 信号 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 使用 (<100 μl), 因此 需要 特定 探针 扩增 目标, 以 转换 为 下游 下游 (光学, 电学 磁学 下游 下游 (光学, 电学 磁学 下游 下游 的 的 信号 信号 [53, 54, 54, 54) ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Plataforma mikrofluidikoetan azido nukleikoak detektatzeko normalean lagin-bolumen txikiak (<100 μl) erabiltzen dira, eta horrek helburuko azido nukleikoen anplifikazioa eskatzen du zunda bereziekin, gero detektatzeko seinale bihurtzeko (optikoa, elektrikoa eta magnetikoa) [53, 54]] .Mikrofluidikan azido nukleikoen anplifikazioak erreakzioak bizkor ditzake, detekzio-mugak optimizatu, lagin-eskakizunak murriztu eta detekzio-zehaztasuna hobetu ditzake [55, 56].Azken urteotan, detekzio azkarra eta zehatza gauzatzean, mikrofluidikan azido nukleikoen anplifikazio metodo ezberdinak aplikatu dira, PCR eta anplifikazio isotermiko erreakzio batzuk barne.Atal honetan sistema mikrofluidikoetan oinarritutako azido nukleikoak detektatzeko metodoak laburbilduko dira.
PCR organismo baten DNAren erreplikazio-prozesuaren simulazioa da, eta horren teoria beste nonbait zehatz-mehatz deskribatzen da eta ez da hemen eztabaidatuko.PCR-k xede-DNA/RNA kopuru oso txikia anplifikatu dezake abiadura esponentzialean, PCR azido nukleikoak azkar detektatzeko tresna indartsua bihurtuz.Azken hamarkadetan, PCR ziklo termikoko sistemaz hornitutako gailu mikrofluidiko eramangarri asko garatu dira arreta puntuko diagnostikoen beharrak asetzeko [57, 58].On-Chip PCR lau motatan bana daiteke (konbentzionala, fluxu jarraitua, espazialki konmutatutakoa eta konbektiboa) tenperatura kontrolatzeko metodo ezberdinen arabera [59].Adibidez, Gee et al.[60] alderantzizko transkripzio zuzeneko PCR kuantitatiboa (RT-qPCR) metodo bat garatu zuten beren plataforma mikrofluidikoan SARS-CoV-2, gripe A eta B birusak eztarriko laginetan detektatzeko (3a. irudia).Park et al.[61] patogenoen analisirako txip sinple bat eraiki zuen film meheko PCR, elektrodoak eta hatzekin funtzionatzen duen polidimetilsiloxanoan oinarritutako modulu mikrofluidiko bat integratuz.Hala ere, bi lanek ohiko PCRren gabezi komunak biltzen dituzte.PCR-k ziklo termikoa behar du, eta horrek gailuaren miniaturizazio gehiago mugatzen du eta proba denbora murrizten du.
Arazo honi aurre egiteko, ezinbestekoa da fluxu jarraituan oinarritutako PCR mikrofluidikoa eta espazio-aldatutakoa garatzea.Suge-kanal luze bat edo kanal zuzen labur bat erabiliz, fluxu jarraituaren PCR-k anplifikazio azkarra eman dezake erreaktiboak aktiboki zirkulatuz, txipz kanpoko ponpa batekin aurrez berotutako hiru zonatan.Eragiketa honek erreakzio-tenperatura ezberdinen arteko trantsizio-fasea saihesten du eta, beraz, proba-denbora nabarmen murrizten du [62] (3b. irudia).Jung et al-en beste ikerketa batean.[63] PCR birakariaren analizatzaile genetiko berri bat proposatu zuen, PCR finkoaren eta fluxuaren ezaugarriak konbinatzen dituen PCR ultraazkar eta multiplexaren alderantzizko transkripziorako (3c. irudia).Azido nukleikoen anplifikaziorako, PCR mikrotxipa hiru berogailu-bloketan biratuko da tenperatura ezberdinetan: 1. Desnaturalizazio-blokea 94°C, 2. Erretiro-blokea 58°C-tan, 3. Hedapen-blokea 72°C-tan.
PCRren aplikazioa mikrofluidikan.DirRT-qPCR-ren irudikapen eskematikoa plataforma mikrofluidiko batean ([60]tik egokitua).b Suge-kanal batean oinarritutako fluxu jarraituaren PCR mikroarray baten irudikapen eskematikoa ([62]tik egokitua).c PCR analizatzaile genetiko birakaria baten irudikapen eskematikoa, mikrotxip batez, hiru berogailu-blokez eta urratseko motor batez osatua ([63]tik egokitua).d Termokonbekzioko PCRren diagrama zentrifugazioarekin eta konfigurazioarekin ([64]tik egokitua).DirRT-qPCR, alderantzizko transkripzio kuantitatibo zuzena polimerasaren kate-erreakzioa
Kapilarrak eta begiztak edo plaka meheak erabiliz, konbekzio-PCR-k azido nukleikoak azkar handitu ditzake konbekzio termiko aske naturalaren bidez, kanpoko ponpa beharrik gabe.Adibidez, polimero olefina ziklikoko plataforma mikrofluidiko bat garatu zen fabrikatutako birakatze-etapa batean, PCR begizta mikrokanal batean zentrifugazioarekin ziklo termikoa erabiltzen duena [64] (3d. irudia).Erreakzio-soluzioa konbekzio termikoaren bidez bultzatzen da, eta etengabe trukatzen ditu tenperatura altua eta baxua egitura eraztundun mikrokanal batean.Anplifikazio-prozesu osoa 10 minututan burutu daiteke 70,5 pg/kanal detekzio muga batekin.
Espero bezala, PCR azkarra tresna indartsua da lagin-erantzunaren diagnostiko molekularra eta analisi multiplexako sistemetarako.PCR azkarrak SARS-CoV-2 detektatzeko behar den denbora nabarmen murrizten du, eta horrek COVID-19 pandemia eraginkorra kontrolatzen laguntzen du.
PCR-k POCTrako egokia ez den termiko-ziklatzaile konplexu bat behar du.Duela gutxi, anplifikazio isotermiko teknikak mikrofluidikan aplikatu dira, besteak beste, LAMP, polimerasa birkonbinasaren anplifikazioa (RPA) eta azido nukleikoen sekuentzian oinarritutako anplifikazioa [65,66,67,68].Teknika hauekin, azido nukleikoak tenperatura konstantean anplifikatzen dira, kostu baxuko eta oso sentikorrak diren POCT gailu eramangarrien sorrera erraztuz diagnostiko molekularrako.
Errendimendu handiko mikrofluidikan oinarritutako LAMP entseguek gaixotasun infekziosoak anitz detektatzeko aukera ematen dute [42, 69, 70, 71].Sistema mikrofluidiko zentrifugo batekin konbinatuta, LAMPak azido nukleikoaren detekzioaren automatizazioa areago erraztu dezake [69, 72, 73, 74, 75].SlipChip spin-and-react bakterio paralelo anitzen bisual detektatzeko garatu zen LAMP [76] erabiliz (4a. irudia).Saiakuntzan LAMP optimizatua erabiltzean, fluoreszentzia-seinalearen eta zarataren arteko erlazioa 5 aldiz gutxi gorabehera zen eta detekzio-muga DNA genomikoaren 7,2 kopia/μl-ra iritsi zen. Gainera, bost bakterio patogeno digestibo arrunten existentzia, besteak beste, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis eta Vibrio parahaemolyticus, metodoan oinarrituta ikusi zen < 60 min. Gainera, bost bakterio patogeno digestibo arrunten existentzia, besteak beste, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis eta Vibrio parahaemolyticus, metodoan oinarrituta ikusi zen < 60 min.Gainera, digestio-aparatuko bost bakterio patogeno arrunten presentzia, besteak beste, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis eta Vibrio parahaemolyticus, metodo honen bidez ikusi da 60 minutu baino gutxiagoan.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 了 原体 的 种 常见 消化道 原体 的 存在, 包括 蜡状, 大 肠杆菌, 肠 沙门 氏 菌, 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌.此外, 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五, 包括 芽孢杆菌, 大 肠杆菌, 肠 氏氏, 弧菌 和 副溶血 副溶血 副溶血 副溶血 副溶血 副溶血 副溶血 副溶血 副溶血 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPHorrez gain, bost bakterio-hesteetako patogeno arrunten presentzia, besteak beste, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius eta Vibrio parahaemolyticus, metodo hau erabiliz bistaratu zen 60 minutu baino gutxiagoan.
Mikrofluidikan LAMP-en abantailen artean, besteak beste, erantzun azkarra eta detekzio miniaturizatua daude.Dena den, erreakzio-tenperatura dela eta (70°C ingurukoa), ezinbestean aerosolak sortzen dira LAMP-ean zehar, eta ondorioz positibo faltsu altua da.Entseguaren espezifikoak, lehen diseinua eta tenperatura kontrola ere optimizatu behar dira LAMPerako.Gainera, txip bakarrean helburu anitz detekzioa ezartzen duten txip diseinuek balio handia dute eta garatu beharko lirateke.Horrez gain, LAMP egokia da txip batean integratutako erabilera anitzeko detekziorako, eta horrek garrantzi handia du, baina garapenerako tarte handia dago oraindik.
LAMP-en positibo faltsu-tasa altua partzialki murriztu daiteke RPArekin, erreakzio-tenperatura nahiko baxuak (~ 37 °C) lurrunketa-arazo gutxi ekartzen baititu [77].RPA sisteman, kontrako bi primerek DNAren sintesia hasten dute birkonbinasa bati lotuz eta anplifikazioa 10 minuturen buruan osa daiteke [78,79,80,81].Hori dela eta, RPA prozesu osoa PCR edo LAMP baino askoz azkarragoa da.Azken urteotan, teknologia mikrofluidikoak RPAren abiadura eta zehaztasuna are gehiago hobetzen dituela frogatu da [82,83,84].Adibidez, Liu et al.[85] alboko fluxu polimerasa birkonbinasaren anplifikazio-azterketa mikrofluidiko integratua garatu zuen SARS-CoV-2 detektatzeko, alderantzizko transkripzioa RPA (RT-RPA) eta alboko fluxuaren proba-banda detektatzeko sistema unibertsal bat integratuz.sistema mikrofluidiko bakar batean.4b) irudia.Detekzio-muga kopia 1/µl edo 30 kopia/lagin da, eta detekzioa 30 minutu inguru egin daiteke.Kong et al.gailu mikrofluidiko eramangarri bat garatu dute.[86] gorputz-tenperatura eta telefono mugikorrean oinarritutako fluoreszentzia detektatzeko sistema erabili zituen GIB-1 DNA azkar eta zuzenean detektatzeko RPA erabiliz (4c irudia).RPA saiakuntza eramangarriak xede-sekuentziaren 100 kopia/mL detektatzen ditu 24 minutuko epean, eta GIB-1 kutsatutako haurren diagnostiko azkarrerako potentzial handia erakusten du baliabide mugatuetan.
Anplifikazio isotermikoa arreta puntuko probetan (POCT).SlipChip spin eta erreakzioaren garapena eta ekoizpena.Plasmako soldadura egin ondoren, goiko eta beheko txirbilak azkoin multzo batekin muntatu ziren azken txipa osatzeko ([76]tik egokitua).b COVID-19 detektatzeko MI-IF-RPA sistemaren eskema ([85]tik egokitua).c GIB-1 DNA azkar detektatzeko RPA proba eramangarri baten eskema ([86]tik egokitua).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboxifluoreszeina, giza immunoeskasiaren birusa GIB, RPA birkonbinasa polimerasa anplifikazioa, LED argi-igorle diodoa, MI-IF-RPA mikrofluuridiko polimerasa integratua Anplifikazioa
Mikrofluidikoan oinarritutako RPA azkar garatzen ari da, hala ere, txiparen fabrikazioaren eta erreakzioaren kontsumoaren kostua handiegia da eta murriztu egin behar da teknologia honen erabilgarritasuna areagotzeko.Gainera, RPAren sentsibilitate handiak produktu ez-espezifikoen anplifikazioan eragin dezake, batez ere kutsaduraren aurrean.Muga hauek sistema mikrofluidikoetan RPAren aplikazioan eragina izan dezakete eta optimizazio gehiago merezi dute.Hainbat helburutarako ongi diseinatutako abiarazleak eta zundak ere beharrezkoak dira POCT-en RPAn oinarritutako estrategia mikrofluidikoen bideragarritasuna hobetzeko.
Cas13 eta Cas12a azido nukleikoak ausaz mozteko gaitasuna dute eta, horrela, detekzio eta diagnostiko tresna gisa garatu daitezke.Cas13 eta Cas12a helburuko DNA edo RNArekin lotzean aktibatzen dira, hurrenez hurren.Behin aktibatuta, proteina inguruko beste azido nukleiko batzuk mozten hasten da, eta ondoren, patogeno espezifikoen azido nukleikoei zuzendutako RNA gidariek itzalitako zunda fluoreszenteak moztu eta fluoreszentzia askatu dezakete.Teoria horretan oinarrituta, Kellner et al.[87] Cas13-n oinarritutako metodo bat garatu zuten [Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], eta Broughton et al.[88] Cas12a-n oinarritutako beste ikuspegi bat garatu zuen [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
Azken urteotan, CRISPRn oinarritutako azido nukleikoak detektatzeko hainbat metodo agertu dira [89, 90].CRISPR oinarritutako ohiko metodoek denbora asko eta lan intentsiboa izaten dute askotan, azido nukleikoen erauzketa, anplifikazioa eta CRISPR detekzioa barne.Likidoak airera esposizioak emaitza positibo faltsuak izateko aukera areagotu dezake.Aurrekoa kontuan hartuta, CRISPRn oinarritutako sistemek optimizazio premia handia dute.
CRISPR-Cas12a eta CRISPR-Cas13a detektatzeko aplikazioetarako 24 analisi paralelo egin ditzakeen plataforma pneumatikoki kontrolatutako mikrofluidiko plataforma bat garatu da [91].Sistemak azido nukleikoen anplifikazioa saihesten duen fluoreszentzia detektatzeko gailu batez hornituta dago eta DNA femtomolarra eta RNA laginak automatikoki detektatzen ditu.Chen et al.[92] birkonbinasaren anplifikazio integratua CRISPR-Cas12a sistemarekin mikrofluidika zentrifugoan (5a. irudia).Lan honek bi prozesu hauek integratzeko zailtasuna gainditzen du, Cas12a-k DNA mezularia digeritu eta anplifikazio-prozesua galarazi dezakeelako.Horrez gain, Chen et al.[92], gainera, erreakzio-erreaktiboak aurrez biltegiratu zituen kontrol mikrofluidiko zentrifugo batean, prozesu osoa automatikoki osatzeko.Beste lan batean, Silva et al.[93] CRISPR/Cas12a anplifikaziorik gabeko diagnostiko metodo bat eta SARS-CoV-2 detektatzeko smartphone bat garatu zuen (5b. irudia).Telefono mugikorrean oinarritutako anplifikaziorik gabeko sistema gisa ezagutzen den saiakuntza honek CRISPR/Cas-en menpeko entzima bat barne hartzen du, kanal mikrofluidikoetan katalasak sortutako burbuila-seinaleen bistaratzean oinarritzen dena.Azido nukleiko 50 kopia/µl baino gutxiagoko detekzio sentikorra aurre-anplifikaziorik gabe, laginaren injekziotik seinaleen irakurketara arte 71 minutu baino ez ditu behar.
CRISPRn oinarritutako azido nukleikoak detektatzeko metodoak.CRISPR-n oinarritutako diagnostiko molekular integraturako POCT zentrifugoa ([92]tik egokitua).b SARS-CoV-2 telefonoan oinarritutako analisirako CASCADE testaren garapena ([93]tik egokitua).RAA birkonbinasaren anplifikazioa, PAM aldameneko protospacer motiboa, CRISPR errepikapen palindromiko laburrak multzokatuta tarte erregularretan, CASCADE sistema telefono mugikorraren anplifikaziorik gabe CRISPR/CAS-en menpeko entzimekin, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]karbodiimida hidrokloruroa EDC
Azido nukleikoen detekzioaren azken urratsa denez, seinaleen detekzioak zuzenean islatzen ditu diagnostiko emaitzak eta faktore kritikoa da POCT eraginkor, sentikor eta zehatza garatzeko.Seinaleak hainbat metodo erabiliz irakur daitezke, hala nola estrategia fluoreszenteak, elektrokimikoak, kolorimetrikoak eta magnetikoak.Atal honetan, ikuspegi bakoitzaren arrazoia deskribatzen dugu eta mikrofluidikan gaixotasun infekziosoen diagnostiko molekularra konparatzen dugu.
Fluoreszentzian oinarritutako estrategiak oso erabiliak dira gaixotasun infekziosoen POCT diagnostikorako, sentsibilitate bikainaren, kostu baxuaren, funtzionamendu errazaren eta arreta puntuko analisiaren abantaila nabarmenak direla eta [94, 95].Estrategia hauek etiketatutako fluoroforoak erabiltzen dituzte, hala nola tindagai fluoreszenteak eta nanomaterialak, seinale detektagarri bat sortzeko (fluoreszentzia hobetzea edo itzaltzea).Aurkikuntza honek iradokitzen du fluoreszentzian oinarritutako estrategiak fluoreszentzia zuzeneko etiketa, seinalea piztea eta seinalea itzaltzea fluoreszente detekzioan bana daitezkeela [96].Etiketa fluoreszente zuzenak detektatzeko etiketa fluoreszente bereziak erabiltzen ditu helburu bati selektiboan lotzen direnean fluoreszentzia kopuru zehatz bat sortzen duten ligando espezifikoak etiketatzeko.Seinalean oinarritutako fluoreszentzia detektatzeko, seinale fluoreszentearen kalitatea interesaren magnitudearekin positiboki lotuta dago.Fluoreszentzia-intentsitatea arbuiagarria da helbururik ezean eta detekta daiteke helburu nahikoa dagoenean.Aitzitik, fluoreszentzia "seinale-off" bidez hautematen den fluoreszentzia-intentsitatea xede-kopuruarekiko alderantziz proportzionala da, hasiera batean balio maximo batera iristen da eta pixkanaka murrizten da helburua handitu ahala.Adibidez, CRISPR-Cas13a xede-menpeko trans-mozketa mekanismoa erabiliz, Tian et al.[97]-ek errekonozimendu estrategia berri bat garatu zuen alderantzizko transkripzioa zuzenean saihesten duten RNAak detektatzeko (6a. irudia).Helburuko RNA osagarriekin lotzean, CRISPR-Cas13-RNA konplexua aktibatu daiteke, RNA berriemaile ez-espezifikoaren bidez transkolateral mozketa eraginez.Fluoreszentez etiketatutako berriemailea [fluoroforoa (F)] kencher-ak (Q) osorik itzaltzen du eta aktibatutako konplexuak zatitzen duenean fluoreszentzen da.
Detekzio elektrokimikoaren abantaila detekzio abiadura handia, ekoizpen erraza, kostu baxua, eramateko erraza eta kontrol automatikoa da.POCT aplikazioetarako metodo analitiko indartsua da.Grafenoaren eremu-efektuko transistoreetan oinarrituta Gao et al.[98] Borrelia burgdorferi bakterioetatik Lyme gaixotasunaren antigenoak detektatzeko nanobiosentsore bat garatu zuen 2 pg/mL-ko detekzio mugarekin (6b. irudia).
POCT aplikazioetan saiakuntza koloremetrikoak erabili dira, eramangarritasunaren, kostu baxuaren, prestatzeko erraztasunaren eta irakurketa bisualaren abantailez baliatuz.Detekzio koloremetrikoak peroxidasa edo peroxidasa antzeko nanomaterialen oxidazioa, nanomaterialen agregazioa eta koloratzaile adierazleak gehitzea erabil ditzake xede azido nukleikoen presentziari buruzko informazioa kolore-aldaketa ikusgarrietan bihurtzeko [99, 100, 101].Nabarmentzekoa, urrezko nanopartikulak oso erabiliak dira estrategia kolorimetrikoak garatzeko, eta kolore aldaketa azkar eta esanguratsuak eragiteko duten gaitasuna dela eta, gero eta interes handiagoa dago gaixotasun infekziosoak in situ diagnostikatzeko POCT plataforma kolorimetrikoak garatzeko [102].Dispositibo mikrofluidiko zentrifugo integratu batekin [103], kutsatutako esne-laginetan elikagaiak transmititzen dituzten patogenoak automatikoki hauteman daitezke 10 bakterio-zelulen mailan, eta emaitzak 65 minutuko epean ikus daitezke (6c. irudia).
Sentsazio magnetikoko teknikek analisiak zehaztasunez detektatu ditzakete material magnetikoak erabiliz, eta interes handia izan da POCT aplikazioetan azken hamarkadetan.Sentsazio magnetiko-teknikek abantaila paregabe batzuk dituzte, hala nola, kostu baxuko material magnetikoak osagai optiko garestiak baino.Hala ere, eremu magnetikoa erabiltzeak detekzio eraginkortasuna hobetzen du eta laginak prestatzeko denbora murrizten du [104].Horrez gain, zundaketa magnetikoaren emaitzek espezifikotasun, sentikortasun eta seinale-zarata erlazio handia erakusten dute lagin biologikoen hondo magnetiko seinale hutsalaren ondorioz [105].Sharma et al.tunel magnetikoko lotunean oinarritutako biosentsore bat integratu zuen mikrotxip eramangarriko plataforma batean.[106] patogenoen detekzio multiplexetarako (6d. irudia).Biosentsoreek sentikortasunez detektatzen dituzte patogenoetatik isolatutako azido nukleiko azpinanomolak.
Seinaleak hautemateko metodo tipikoa.Cas13a-ren detekzio hiperlokalizatuaren kontzeptua ([97]tik egokitua).b Grafeno nanobiosentsore FET Lyme GroES scFv-rekin konbinatuta ([98]tik egokitua).c Elikagaien bidezko patogenoak detektatzeko indikazio koloremetrikoak txip mikrofluidiko zentrifugo batean: 1. eta 3. zenbakiak xede patogenoekin, eta 2., 4. eta 5. zenbakiak xede patogenorik gabeko laginak ([103]tik egokitua) .d Tunel magnetikoko lotunean oinarritutako biosentsorea, plataforma bat, blokeo-anplifikadore integratua, kontrol-unitatea eta seinalea sortzeko/eskuratzeko elikadura-iturri bat barne ([106]tik egokitua).GFET Grafeno FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metakrilatoa
Goiko detekzio metodoen ezaugarri bikainak izan arren, desabantailak dituzte oraindik.Metodo hauek alderatzen dira (1. taula), xehetasunak dituzten aplikazio batzuk barne (alde onak eta txarrak).
Mikrofluidikaren, sistema mikroelektromekanikoen, nanoteknologiaren eta materialen zientziaren garapenarekin, gaixotasun infekziosoak detektatzeko txip mikrofluidikoaren erabilera etengabe aurrera doa [55,96,107,108].Miniaturazko ekipoen eta fluidoen manipulazio zehatzak diagnostikoen zehaztasuna eta kostu-eraginkortasuna laguntzen du.Hori dela eta, garapen gehiago lortzeko, txipak optimizatzeko eta berritzeko ahaleginak egin dira, egitura eta funtzio desberdinak dituzten hainbat txip mikrofluidiko sortuz.Hemen laburki aurkeztuko ditugu hainbat plataforma mikrofluidiko mota arruntak eta haien ezaugarriak alderatzen ditugu (alde onak eta txarrak).Horrez gain, behean zerrendatzen diren adibide gehienak SARS-CoV-2-ren aurkako borrokan oinarritzen dira batez ere.
LOCCak sistema analitiko konplexu miniaturizaturik ohikoenak dira eta haien eragiketak oso miniaturizatuak, integratuak, automatizatuak eta paralelizatuak dira laginak injekziotik eta prestaketatik, fluxu-kontroletik eta likidoen detekziotik [109, 110].Likidoak arreta handiz diseinatutako geometria eta efektu fisiko askoren elkarrekintzaren bidez manipulatzen dira, hala nola presio-gradienteak, ekintza kapilarra, elektrodinamika, eremu magnetikoak eta uhin akustikoak [111].LOCC-k abantaila bikainak erakusten ditu errendimendu handiko emanaldian eta detekzio anitzetan, analisi-abiadura azkarrarekin, laginaren tamaina txikiarekin, potentzia-kontsumo txikiarekin eta kudeaketa eta funtzionamendu eraginkortasun handikoarekin;hala ere, LOCC gailuak oso delikatuak dira, eta fabrikazioa, ontziratzea eta interfazea.Hala ere, multiplexatzeak eta berrerabiltzeak zailtasun handiak dituzte [96].Beste plataformekin alderatuta, LOCC-k abantaila paregabeak ditu aplikazio-aniztasun handienari eta teknologia-bateragarritasun onenari dagokionez, baina bere desabantailak ere nabariak dira, hots, konplexutasun handia eta errepikakortasun eskasa.Kanpoko ponpen menpekotasunak, askotan handiak eta garestiak direnez, are gehiago mugatzen du haien erabilera POCTn.
COVID-19 agerraldian, LOCCk arreta handia jaso zuen.Aldi berean, hainbat teknologia batzen dituzten hainbat txip berri daude.Adibidez, telefono adimendunak gaur egun asko erabiltzen dira analitika-gailu eramangarri gisa eta LOCC integratzeko potentzial handia dute.Sun et al.[21]-ek bost patogenoren azido nukleikoen sekuentzia espezifikoak multiplexatzea ahalbidetzen duen txip mikrofluidiko bat fabrikatu zuen, SARS-CoV-2 barne, LAMP erabiliz eta erreakzioa amaitu eta ordubeteko epean smartphone batekin aztertu zituen.Beste adibide gisa, Sundah et al.[112]-ek etengailu molekular bat sortu zuen [trantsizio-egoera molekularren etengailuaren bidezko anplifikazio katalitikoa (CATCH)] SARS-CoV-2 RNA helburuak zuzenean eta sentikorra detektatzeko telefonoak erabiliz. CATCH LOCC eramangarriarekin bateragarria da eta errendimendu handiagoa lortzen du (gutxi gorabehera 8 RNA kopia/μl; < 1 h giro-tenperaturan) [112]. CATCH LOCC eramangarriarekin bateragarria da eta errendimendu handiagoa lortzen du (gutxi gorabehera 8 RNA kopia/μl; < 1 h giro-tenperaturan) [112]. Harrapatu Совместим с портативным locc и обеспечивает и обеспечивает и обеспечивае превоспечную производительность (примерно 8 копий рнк / мкл; <1 ч при комнатной температуре) [112]. CATCH LOCC eramangarriarekin bateragarria da eta errendimendu bikaina eskaintzen du (gutxi gorabehera 8 RNA kopia/µl; < 1 h giro-tenperaturan) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 Harrapatu Совместим с портативными locc и обладает превосходной превосходительностью (примерно 8 копий рнк / мкл; <1 часа при комнатной температуре) [112]. CATCH LOCC eramangarriekin bateragarria da eta errendimendu bikaina du (gutxi gorabehera 8 RNA kopia/µl; < ordubete giro-tenperaturan) [112].Horrez gain, diagnostiko molekularretarako LOCC gailuek indar eragile batzuk ere erabiltzen dituzte, hala nola hutsunea, luzapena eta eremu elektrikoak.Kang et al.[113]-k denbora errealeko nanoplasma-chip-an PCR ultra-azkarra frogatu zuen COVID-19-ren diagnostiko azkar eta kuantitatiboa egiteko, hutsuneko PCR likido plasmonikoko txipa erabiliz.Li et al.[114]-k, ondoren, COVID-19ren diagnostikoa ahalbidetzen zuen txip mikrofluidiko bat garatu zuen.Plataformak RT-LAMP anplifikazio sistema erabiltzen du lagin bat kualitatiboki positiboa ala negatiboa den zehazteko.Ondoren, Ramachandran et al.[115] eremu elektriko-gradiente egokiak lortu zituen isotakoforesia (ITP) erabiliz, mikrofluidikan inplementatutako ioi-fokatze-teknika selektiboa.ITP-rekin, nasofaringearen lagin gordinen xede-RNA automatikoki araz daiteke.Gero Ramachandran et al.[115] ITP arazketa hau ITP-rekin hobetutako LAMP eta CRISPR saiakuntzekin konbinatuz SARS-CoV-2 detektatu zuen giza nasofaringearen laginetan eta lagin klinikoetan 35 minutu inguru.Gainera, ideia berriak sortzen ari dira etengabe.Jadhav et al.[116] gainazalean hobetutako Raman espektroskopia batean oinarritutako diagnostiko-eskema bat proposatu zuen, bertikalki orientatutako urre/zilarrez estalitako karbono-nanohodiak edo botatzeko elektrospun mikro/nanohodiak dituen gailu mikrofluidiko batekin konbinatuta.Mintz funtzionalizatutako iragazki mikrokanalak botatzekoak dira.Gailuak hainbat gorputz-likido/exudaziotako birusak xurgatzen ditu, hala nola listua, nasofaringea eta malkoak.Horrela, birusaren titulua ugaria da eta birusa zehaztasunez identifikatu daiteke Raman sinaduraren bidez.
LOAD plataforma mikrofluidiko zentrifugo bat da, non prozesu guztiak mikroegituratutako substratu bat biratzen duen maiztasun-protokolo baten bidez kontrolatzen dituena [110].LOAD gailua indar zentrifugoa indar eragile garrantzitsu gisa erabiltzearen ezaugarria da.Likidoak ere kapilarren, Eulerren eta Coriolisen indarren mende daude.Zentrifugagailu bat erabiliz, analisiak etengabeko funtzionamendu likidoan egiten dira, erradial barrutik kanporantz, kanpoko hodi, ponpa, eragingailu eta balbula aktiboen beharra ezabatuz.Laburbilduz, kontrol metodo bakar batek funtzionamendua errazten du.Karga-zentrotik distantzia berera dagoen kanal mikrofluidiko berean likidoari eragiten dioten indarrak berdinak dira, eta horrek kanalaren egitura errepikatzea ahalbidetzen du.Hortaz, LOAD ekipamendua diseinatzeko eta fabrikatzeko errazagoa eta ekonomikoagoa da LOCC ekipo konbentzionalak baino, erreakzioak neurri handi batean independenteak eta paralelizatuak diren bitartean;hala ere, ekipo zentrifugoen erresistentzia mekaniko handia dela eta, eskuragarri dagoen txip-materiala mugatua da eta bolumen txikiak zailak dira.kotxera.Aldi berean, LOAD gailu gehienak erabilera bakarrerako diseinatuta daude, eta hori garestia da eskala handiko detekziorako [96, 117, 118, 119].
Azken hamarkadetan, LOAD-ek, etorkizun handiko gailu mikrofluidikotzat hartzen dena, arreta handia jaso du ikertzaile eta fabrikatzaileen aldetik.Horrela, LOAD-ek onarpen handia lortu du eta patogeno infekziosoen diagnostiko molekularra egiteko erabili da [120, 121, 122, 123, 124], batez ere COVID-19 agerraldian.Adibidez, 2020 amaieran, Ji et al.[60]-k RT-qPCR entsegu zuzena frogatu zuen SARS-CoV-2 eta A eta B gripearen infekzioak detektatzeko paralelo azkarra eta automatizatua eztarriko laginetan.Orduan Xiong et al.[74]-ek LAMP-n integratutako diskoide mikrofluidiko plataforma bat aurkeztu zuen, 40 minutuko epean zazpi giza arnas koronavirusen, SARS-CoV-2 barne, detektatzeko azkar, zehatz eta aldi berean.2021 hasieran, de Oliveira et al.[73] poliestirenozko toner zentrifugo mikrofluidiko txip bat frogatu zuen, eskuz hatz-punta biratzaile batekin funtzionatua, RT-LAMP COVID-19-ren diagnostiko molekularra egiteko.Ondoren, Dignan et al.[39] zentrifugagailu eramangarri automatizatu bat aurkeztu zuen SARS-CoV-2 RNA-a garbiketa buccal ataletatik zuzenean arazteko.Medved et al.[53] lineako SARS-CoV-2 aerosolak lagintzeko sistema bat proposatu zuen, bolumen txikiko txip fluoreszente mikrofluidiko birakaria duena, 10 kopia/μL-ko detekzio-muga batekin eta 15 minutuko gutxieneko ziklo-atalasearekin.Suarez et al.[75] berriki SARS-CoV-2 RNA-a bero-inaktibatuta dauden nasofaringe-laginetako laginetan LAMP bidez detektatzeko plataforma mikrofluidiko zentrifugo modular integratuaren garapena jakinarazi du.Adibide hauek COVID-19ren diagnostiko molekularrean LOAD-en onura eta promesa handiak erakusten dituzte.
1945ean Muller eta Clegg-ek [125] kanal mikrofluidikoak aurkeztu zituzten paperean iragazki-papera eta parafina erabiliz.2007an, Whitesides taldeak [126] proteina eta glukosa probak egiteko paperezko lehen plataforma funtzionala sortu zuen.Papera substratu ezin hobea bihurtu da mikrofluidikarako.Paperak berezko propietateak ditu, hala nola hidrofilia eta egitura porotsua, biobateragarritasun bikaina, pisu arina, malgutasuna, tolesgarritasuna, kostu baxua, erabiltzeko erraztasuna eta erosotasuna.µPAD klasikoak paperezko substratuetan eraikitako egitura hidrofilo/hidrofoboz osatuta daude.Hiru dimentsioko egituraren arabera, μPADak bi dimentsioko (2D) eta hiru dimentsioko (3D) μPADetan bana daitezke.2D µPAD-ak muga hidrofobikoak eratuz ekoizten dira kanal mikrofluidikoak sortzeko, eta 3D µPAD-ak, berriz, 2D mikrofluidikoaren geruza pilaz egin ohi dira, batzuetan papera tolestuz, irristatze-teknikez, kanal irekiz eta 3D inprimatuz [96].μPAD-ko fluido urtsuak edo biologikoak batez ere indar kapilarren bidez kontrolatzen dira kanpoko energia-iturririk gabe, eta erreaktiboak aurrez gordetzea, laginak maneiatzea eta multiplex detekzioa erraztuz.Hala ere, fluxu-kontrol zehatza eta multiplex detekzioa oztopatzen dute detekzio-abiadura, sentikortasuna eta berrerabilgarritasun nahikoa ez izateak [96, 127, 128, 129, 130].
Ezohiko plataforma mikrofluidiko gisa, μPAD asko sustatu eta garatu da HCV, GIB eta SARS-CoV-2 bezalako gaixotasun infekziosoak diagnostikatzeko [131, 132].HCV selektiboa eta sentikorra detektatzeko, Tengam et al.[133] paper fluoreszentean oinarritutako biosentsore berri bat garatu zuen, pirrolidinil peptidoan oinarritutako azido nukleikoko zunda oso espezifikoa erabiliz.Azido nukleikoak kobalenteki inmobilizatuta daude partzialki oxidatutako zelulosa-paperean, amino taldeen eta aldehido taldeen arteko alkilazio erreduktiboaren bidez, eta detekzioa fluoreszentzian oinarritzen da.Seinale hauek kamera fluoreszente eramangarri batekin bereziki egindako tramankulu batek irakur ditzake telefono mugikorraren kamerarekin batera.Ondoren, Lu et al.[134] paperean oinarritutako elektrodo malgu bat diseinatu zuen, nikel/urrezko nanopartikula/karbono nanohodiak/polivinil alkoholaren esparru organometalikoen konpositeetan oinarritutako GIBaren xedea detektatzeko DNA hibridazioaren bidez metileno urdina DNA redox adierazle gisa erabiliz.Duela gutxi, Chowdury et al.[135]-ek arreta puntuko µPAD probak egiteko plataforma-diseinu hipotetikoa aurkeztu zuen pazientearen listu gordina erabiliz LAMParekin eta irudi eramangarrien teknologiarekin konbinatuta COVID-19 analitoak detektatzeko.
Alboko fluxuaren probek fluidoak indar kapilarren bidez gidatzen dituzte eta fluidoen mugimendua kontrolatzen dute substratu porotsuen edo mikroegituratuen hezegarritasunaren eta ezaugarrien arabera.Alboko fluxu-gailuek laginak, konjokatuak, inkubagailuak eta detekzioa eta xurgatzaileak dituzte.LFAko azido nukleikoko molekulek lotze-gunean aldez aurretik gordeta dauden lotzaile espezifikoak ezagutzen dituzte eta konplexu gisa lotzen dira.Likidoa inkubazio- eta detekzio-plaketatik igarotzean, konplexuak saiakuntza- eta kontrol-lerroetan kokatutako harrapaketa-molekulek harrapatzen dituzte, begi hutsez zuzenean irakur daitezkeen emaitzak erakutsiz.Normalean, LFA 2-15 minututan osa daiteke, hau da, aurkikuntza tradizionala baino azkarragoa.Mekanismo berezia dela eta, LFAk eragiketa gutxi behar ditu eta ez du ekipamendu gehigarririk behar, eta horrek oso erabilerraza egiten du.Fabrikatzeko eta miniaturizatzeko erraza da, eta paperean oinarritutako substratuen kostua txikiagoa da.Dena den, analisi kualitatiborako bakarrik erabiltzen da, eta detekzio kuantitatiboa oso zaila da, eta multiplexazio-gaitasuna eta errendimendua oso mugatuak dira, eta azido nukleiko nahikoa bakarra detektatu daiteke aldi berean [96,110,127].
LFAren aplikazio gehienak immunoensayoetara bideratzen badira ere, LFA txip mikrofluidikoetan diagnostiko molekularretarako erabiltzea ere eraginkorra eta ezaguna da [136].B hepatitisaren birusaren kasuan, GIB eta SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137]-k gorako bihurketa nanopartikulen LFA plataforma bat proposatu zuen eta plataforma miniaturizatu eta eramangarri honen aldakortasuna frogatu zuen helburu anitzen detekzio sentikor eta kuantitatiboaren bidez, hala nola HBV azido nukleikoa.Horrez gain, Fu et al.[138] GIB-1 DNAren kontzentrazio baxuetan analisi kuantitatiborako gainazalean hobetutako Raman espektroskopian oinarritutako LFA berri bat frogatu zuen.SARS-CoV-2 detektatzeko azkar eta sentikorra lortzeko, Liu et al.[85] mikrofluidiko integratutako RPA alboko fluxuaren analisia garatu zuen RT-RPA eta alboko fluxuaren detektatzeko sistema unibertsala sistema mikrofluidiko bakar batean konbinatuz.
Hainbat plataforma mikrofluidikoen aplikazioa ikasketa zehatzen arabera aldatzen da, plataformen gaitasun eta abantailak aprobetxatuz.Balbula, ponpa eta hodi merkeak dituenez, LOCC aplikazio aniztasunerako eta elkarreragingarritasunerako plataformarik osatuena da, garapenerako lekurik handienarekin.Hori dela eta, espero eta gomendatzen dugu azterketa berrienak LOCCn egitea lehen saiakera gisa eta baldintzak optimizatzea.Gainera, sisteman metodo eraginkor eta zehatzagoak aurkitu eta erabiltzea espero da.LOAD-ek lehendik dauden LOCC gailuetako fluidoen kontrol zehatzean nabarmentzen du eta unitate bakarreko abantailak erakusten ditu indar zentrifugoaren bidez, kanpoko unitateen beharrik gabe, erantzun paraleloak bereizi eta sinkronizatu daitezkeen bitartean.Horrela, etorkizunean, LOAD eskuzko eragiketa gutxiago eta teknologia helduago eta automatizatuagoko plataforma mikrofluidiko nagusia bihurtuko da.µPAD plataformak LOCC eta paperean oinarritutako materialen abantailak konbinatzen ditu kostu baxuko eta erabilera bakarreko diagnostikoetarako.Hori dela eta, etorkizuneko garapenak teknologia eroso eta ondo finkatuetan zentratu beharko luke.Horrez gain, LFA begi hutsez detektatzeko egokia da, laginaren kontsumoa murrizteko eta detekzioa bizkortuko duela hitzemanez.2. taulan plataforma konparaketa zehatza ageri da.
Analisi digitalek mikroerreaktore askotan banatzen dute lagina, eta horietako bakoitzak helburu molekula kopuru zehatz bat dauka [139, 140].Entsegu digitalek abantaila nabarmenak eskaintzen dituzte kuantitazio absolutua egiteko, milaka esperimentu biokimiko paralelo aldi berean eta banan-banan eginez, fase jarraituan baino, mikra eskalako konpartimentuetan.Mikrofluidika tradizionalarekin alderatuta, konpartimentuen erreakzioek laginaren bolumena murrizten dute, erreakzioaren eraginkortasuna areagotu eta beste metodo analitiko batzuekin erraz integra daitezke kanal, ponpa, balbula eta diseinu trinkoen beharrik gabe [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Disoluzioen bereizketa uniforme eta zehatza lortzeko bi metodo hauek erabiltzen dira, besteak beste, zelulak, azido nukleikoak eta beste partikula edo molekulak bezalako erreaktiboak eta laginak: (1) interfaze likidoaren ezegonkortasuna ustiatzen duten emultsioak askatzea;(2) array zatiketa gailuaren muga geometrikoek egiten dute.Lehenengo metodoan, mikrokanaletan erreaktiboak eta laginak dituzten tantak metodo pasiboen bidez sor daitezke, hala nola, korronte bateratua, fluxu gurutzatua, fluxuaren fokua, emultsio mailakatua, mikrokanalaren emultsioa eta mintzak ebakidura-indar likatsuen bidez eta kanal-aldaketarekin emultsionatzeko.lokalizazioa [143, 145, 146, 148, 149] edo metodo aktiboak erabiliz [150, 151], kontrol elektriko, magnetiko, termiko eta mekanikoaren bidez energia gehigarria sartzen dutenak.Azken ikuspegi honetan, ganbera mikrofluidikoetako fluido-bolumenaren uniformetasun onena tamaina bereko egitura espazialak mantenduz partekatzen da, hala nola mikrohobiak eta gainazaleko multzoak [152,153,154].Nabarmentzekoa, tantak mikrofluidika digitalean (DMF) oinarritutako elektrodo-matrizeetan ere sor daitezkeen eta manipulatu daitezkeen fluxu-atal nagusiak dira.Dielektrikoen elektrohezetzea hobekien aztertutako DMF teorietako bat da, dielektrikoen elektrohezeteak tanta indibidualen manipulazio zehatza ahalbidetzen baitu, likidoaren forma eta alde ezberdinetatik igarotzen diren seinale elektriko asimetrikoak kontrolatuz [141, 144].DMFn tantekin egindako eragiketa nagusien artean sailkatzea, zatitzea eta batzea [151, 155, 156] daude, analisi-eremu ezberdinetan aplika daitezkeenak, batez ere detekzio molekularrean [157, 158, 159].
Azido nukleikoen detekzio digitala hirugarren belaunaldiko diagnostiko molekularreko teknologia bat da, ohiko PCR eta denbora errealeko PCR kuantitatiboa (qPCR) jarraituz, errendimendu handiko sekuentziazioarekin eta biopsia likidoarekin batera.Azken bi hamarkadetan, azido nukleiko digitalak azkar garatu dira patogeno infekziosoen diagnostiko molekularraren arloan [160, 161, 162].Azido nukleiko digitalaren detekzioaren erabateko kuantifikazioa laginak eta erreaktiboak banakako konpartimentuetan ontziratzearekin hasten da, xede-sekuentzia bakoitzak konpartimentu bakoitzean sartzeko probabilitate bera duela ziurtatzeko.Teorian, sekzio bakoitzari helburu-sekuentzia anitz eslei daitezke, edo baliteke mikroerreakzio-sistema independenterik ez egotea.Goian deskribatutako hainbat sentsazio-mekanismoen bidez, atalase batetik gorako seinaleak sortzen dituzten mikrobio-helburu-sekuentziak dituzten konpartimentuak begi hutsez edo makina baten bidez ikus daitezke eta positibo gisa etiketatu daitezke, eta atalasearen azpitik seinaleak sortzen dituzten beste konpartimentu batzuk positibo gisa etiketatuta daude. .negatiboak, atal bakoitzeko seinalea boolearra bihurtzen dutenak.Horrela, erreakzioaren ondoren sortutako konpartimentu kopurua eta emaitza positiboen tasa kalkulatuz, proba-laginen jatorrizko kopiak pareka daitezke Poisson-en banaketa-formula erabiliz, kurba estandar baten beharrik gabe, ohiko analisi kuantitatiboetarako beharrezkoa dena. qPCR gisa.[163] Diagnostiko molekularreko metodo tradizionalekin alderatuta, azido nukleiko digitalak hautemateak automatizazio maila handiagoa du, analisi-abiadura eta sentikortasun handiagoa, erreaktibo gutxiago, kutsadura gutxiago eta diseinu eta fabrikazio sinpleagoak ditu.Arrazoi horiengatik, diagnostiko molekularretarako saiakuntza digitalak, batez ere tantetan oinarritutako metodoak, anplifikazioa eta seinaleak irakurtzeko teknikak konbinatuz, ondo aztertu da SARS-CoV-2-ren agerraldi kritikoan.Adibidez, Yin et al.[164] tanta digitalak eta PCR azkarrak konbinatu zituen ORF1ab, N eta RNase P geneak SARS-CoV-2 txip mikrofluidiko batean detektatzeko.Nabarmentzekoa, sistemak seinale positibo bat identifikatzeko gai izan zen 115 segundotan, PCR konbentzionala baino azkarragoa dena, arreta puntuko detekzioan duen eraginkortasuna adieraziz (7a irudia).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] eta Alteri et al.[167] tantaka PCR digitala (ddPCR) ere aplikatu zuen SARS-CoV-2 sistema mikrofluidiko batean emaitza ikusgarriak lortuz.Detekzio-tasa gehiago hobetzeko, Shen et al.[168] ddPCR-n oinarritutako txip-irudiak lortu zituen 15 segundotan irudiak josteko teknikarik erabili gabe, ddPCR teknologia prozesua laborategitik aplikaziora bizkortuz.PCR bezalako anplifikazio termikoko metodoak ez ezik, anplifikazio isotermikoak ere erabiltzen dira erreakzio baldintzak eta erantzun azkarra errazteko.Lu et al.[71] tantak aztertzeko SlipChip garatu zuen, pauso bakarrean dentsitate handiko hainbat tamainatako tantak sortzeko eta LAMP digitala erabiliz SARS-CoV-2 azido nukleikoak kuantifikatzeko (7b irudia).Azkar eboluzionatzen ari den teknologia denez, CRISPR-k azido nukleiko digitalaren detekzioan ere eginkizun garrantzitsua izan dezake irudi kolorimetriko erosoen bidez, azido nukleikoen orban gehigarririk behar izan gabe.Ackerman et al.azido nukleikoen ebaluazio multiplexetarako matrize-erreakzio konbinatzailea garatu zuen.[158]-k gizakiekin lotutako 169 birus detektatu zituen, SARS-CoV-2 barne, CRISPR-Cas13-n oinarritutako azido nukleikoen detektatzeko erreaktiboen tantetan, mikroputzuen saiakuntza batean (7c irudia).Gainera, anplifikazio isotermikoa eta CRISPR teknologia sistema berean erabil daitezke bien onurak uztartzeko.Park et al.[169] CRISPR/Cas12a saio digital bat garatu zen txip mikrofluidiko komertzialean, erauzitako eta beroz hildako SARS-CoV-2 detektatzeko etapa bakarreko RT-RPA batean oinarrituta, seinale laburragoa eta altuagoa duen atzeko planoko detekzioarekin. denbora-erlazioa., barruti dinamiko zabalagoa eta sentsibilitate hobea (7d. irud.).Adibide horien deskribapen batzuk 3. taulan ematen dira.
Azido nukleikoak detektatzeko plataforma digital tipikoa.a PCR digitalaren lan-fluxu azkarrak lau urrats nagusi ditu: laginak prestatzea, erreakzio-nahastearen banaketa, anplifikazio-prozesua eta xede-kuantifikazioa ([164]tik egokitua).b SlipChip tanten analisia erakusten duen eskema dentsitate handiko tantak eratzeko ([71]tik egokitua).c CARMEN-Cas lan-fluxuaren diagrama13 ([158]tik egokitua).d Birus digitalaren detekzio aurreratuaren ikuspegi orokorra CRISPR/Cas-ekin pot batean ([169]-tik egokitua).W/O ur-olioan, polidimetilsiloxano PDMS, PCR polimerasaren kate-erreakzioa, DAQ datu bilketa, PID deribatu integral proportzionala, CARMEN matrize-erreakzio konbinatzailea azido nukleiko multiplexaren ebaluaziorako, SARS-CoV-2, arnas sindrome akutu larria, koronavirus 2, RT Alderantzizko transkriptasa birkonbinasa polimerasa-RPA anplifikazioa, S/B seinalea atzeko planoan